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关键词 肺炎衣原体 抗原 微量荧光免疫 检测
肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，Cpn）是一种非常常见的呼吸道感染病原体。近年来在多种系统的疾病中均有Cpn感染的证据发现，因而日益受到重视。但以往临床诊断Cpn感染所采用的检测方法主要依靠抗体的检测，而且抗体检测采用的是间接微量免疫方法;这样的方法存在诊断不及时、延误治疗、费时、费力等不足，因而我们参照国外的文献介绍，试图在国内建立外周血中Cpn抗原的检测方法。
1 材料与方法
1.1 临床病例的选择 复旦大学附属金山医院心内科住院的病人200例，年龄在30岁以上，性别不作限制，但排除3个月内有不明原因发热和明确由Cpn感染引起的发热。以其中经抗原检测阳性的病例中的29例和阴性的病例中的26例，再做PCR方法检测，进行对照。
1.2 实验方法
1.2.1 主要仪器设备 恒温水浴箱（上海医疗仪器七厂）;-20℃冰箱（日本SANYO）;-70℃冰箱（日本SANYO）;水平高速离心机（上海医用分析仪器厂）;荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）;微波炉（广东顺德微波制品公司）;磁力搅拌棒（华美生物工程公司）;磁搅拌器（华美生物工程公司）;PCR仪（美国BECKMAN公司）。
1.2.2 主要材料、试剂及配制 载玻片（美国BD公司）;微量移液器（华美生物工程公司）;Cpn菌株TW-183（美国华盛顿基金会）;FITC-TT-401（美国华盛顿基金会）;分析纯丙酮（上海试剂一厂）;淋巴细胞分离液（上海华精公司）;新鲜牛奶（市售）;饱和酚（华美生物工程公司）;琼脂糖（华美生物工程公司）;氯仿（华美生物工程公司）;无水乙醇（华美生物工程公司）;蛋白酶K（华美生物工程公司）;PCR MAKˉER（PGEM-3zf（+）/Hae III）（华美生物工程公司）;PCR sysˉtem（华美生物工程公司）
1.3 相关试剂的制备
1.3.1 Cpn菌株牛奶稀释液 Cpn菌株用市售新鲜牛奶按1:10稀释。
1.3.2 0.1M pH7.4PBS 称取9g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na 2 HPO 4 ，0.24g KH 2 PO 4，加蒸馏水至1L混匀。
1.3.3 DNA抽提液 100mM Tris.Cl pH8.0，100mM EDTA，0.5%SDS。
1.3.4 含1%琼脂糖的PBS 将1g琼脂糖粉溶于100ml1.01M pH1.4PBS，室温保存。
1.3.5 TE（pH8.0） 10mM Tris.Cl（pH8.0），1mM EDTA（pH8.0）。
1.3.6 3MNaAc（pH5.2） 800ml蒸馏水中溶解408g NaAc·3H 2 O用冰乙酸调整pH至5.2，加蒸馏水至1L。
1.4 直接微量免疫荧光（DIF）法检测外周血单核细胞（PBMC）中Cpn特异性抗原的方法
1.4.1 PBMC的分离参照Moazed等人 ［1］ 方法略加修改 吸出血浆后的余血用等体积PBS稀释混匀，再缓慢加到含有3ml淋巴细胞分离液的管中，然后于室温下用水平离心机以2200rpm离心30min后，在已出现分层的试管中吸出含有PBMC的云雾状层，并用PBS洗两次，再悬浮于200μl PBS中，-70℃储藏待检。
1.4.2 PBMC中Cpn抗原的检测 参照Timms等 ［2］ 人方法并加以改进:吸取新鲜制备的PBMC悬液10μl（约含PBMC6～10×10 5 个）分别在载玻片上涂出2个直径4～5mm的圆点，丙酮固定3次。其中一个圆点作为空白对照，另一个圆点加上5μl用0.01%伊文氏蓝PBS液稀释后的Cpn单克隆抗体抗FITC-TT-401（工作浓度1:40），置湿盒于37℃温育30min，PBS洗三次，每次5min，蒸馏水洗3次，自然晾干。
1.4.3 荧光显微镜下（HBO200汞灯，第一滤片:BG-12，第二滤片:CG-13和WILD8075）观察均匀大小的特征性苹果绿亮点。测定圆点内的荧光亮点数减去空白圆点内的荧光亮点数后的差数，作为判断Cpn特异性抗原阳性的依据。
1.4.4 阳性对照 Cpn菌株牛奶稀释液做为抗原;阴性对照:PBS代替Cpn单抗FITC-TT-401。平行操作。
1.4.5 抗原阳性判断标准参照Muhlestain等人 ［3］ 的标准 强阳性≥100个亮点/圆点），阳性（>10～100），弱阳性（≥5～10个亮点/圆点），阴性（≤4个亮点/圆点）。本研究中强阳性、阳性、弱阳性均判断为阳性。
1.5 PCR法检测外周血单核细胞中Cpn DNA ［4］
1.5.1 抽提PBMC中DNA 取PBMC悬液50μl（约含PBMC6～10×10 5 个）→加入100μl DNA抽提液，混匀→加入20mg/ml蛋白酶K至100μg/ml→混匀，50℃水浴过夜→打匀浆→加入等体积饱和酚→12000rpm离心10min→取上层水相→加入等体积氯仿→12000rpm离心10min→取上层水相→加入0.1倍体积的3M乙酸钠，2倍体积无水乙醇→混匀冰浴30min→12000rpm离心5min→弃上清→加入等体积70%乙醇→-20℃冰箱10min→12000rpm离心2min→弃上清→室温挥发乙醇→加入100μl TE溶解DNA→放入4℃冰箱备用。
1.5.2 PCR
1.5.2.1 引物 HL-1:5’GTTGTTCATGAAGGCCTACT3’，HR-1:5’TGCATAACCTACGGTGTGTT3’PCR扩增产物为474bp。
1.5.2.2 PCR反应体系 取TE溶解的DNA10μl，10×PCR Buffer5μl，dNTPs1.5μl，引物HL-1、HR-1各1.5μl，Tap酶1μl（2 u ），ddH 2 O29.5μl。总反应体积50μl。
1.5.2.3 PCR热循环 94℃变性10min→94℃×60s→55℃×60s→72℃×60s→72℃×10min 35个循环。
1.5.2.4 对照 阴性对照:无模板DNA的PCR反应体系;阳性对照:Cpn DNA为模板的PCR反应
体系。
1.5.2.5 PCR MAKER:PGEM-3zf（+）/Hae III。
1.5.2.6 1.5%凝胶电泳 5V/cm电泳1h，紫外灯下观察结果。
1.6 统计 以Kappa值来判断一致性强度的强弱。①<0:弱;②0～0.2:轻;③0.21～0.40:尚好;④0.41～0.60:中度;⑤0.61～0.80:高度;⑥0.81～1.00:最强。
2 结果
2.1 DIF检测人PBMC中Cpn抗原结果 见图1～3。
2.2 PCR方法检测PBMC中Cpn DNA结果 见图4。
2.3 PCR方法检测PBMC中Cpn DNA结果与DIF法检测Cpn-Ag结果对比 29例用单抗经DIF法检测的Cpn抗原阳性的PBMC标本中，23例检测到Cpn DNA。26例用单抗经DI法检测的Cpn抗原阴性的PBMC标本中，1例检测到Cpn DNA。由此可见Cpn抗原检测与PCR有高度的一致性。详见表1。
表1 两种方法检测结果对比
3 讨论
肺炎衣原体（Chlamydia Pneumoniae，Cpn）是Grayeton等在学生急性呼吸道感染中发现的 ［5］ 。Cpn的感染最常见部位在呼吸道。近年来随着研究的深入，其感染已在多种系统疾病中被发现，特别是在非典型性肺炎的鉴别中一度引起争议。争议的原因除了临床表现不典型外，检测手段的不丰富也是一个重要原因。在心血管疾病中，近年来已有越来越多的证据表明，Cpn感染与动脉粥样硬化性疾病，如冠心病、心肌梗死等相关。为了心血管病人相关感染的及早诊断和干预以及相关研究的需要，尽早建立及时、有效、可靠的Cpn检测方法成了当务之急。
目前临床上常用的检测Cpn感染的手段有:Cpn的分离和培养、血清抗体的检测和动脉硬化斑块中抗原的检测等方法。
Cpn的分离和培养虽然最为“古老”，但Cpn的分离和培养是检测Cpn最为可靠和最为直接的方法，而且最早发现的衣原体就是从患者的眼结膜上提取用鸡胚培养分离出来的。早期用于Cpn体外培养的细胞是McCoy和HeLa细胞，但培养成功的滴度不高;此后Kuo和Grayston ［6］发现HL细胞对Cpn感染敏感;还有人报道Hep-2同样对其有敏感性。1992年，Wang等［7］ 用六种Cpn不同株型感染H-292，HEP-2和HeLa细胞，发现H-292的包涵体产量最高，Hep-2次之，HeLa最低;而Roblin等 ［8］ 用TW-138及两种临床分离到的Cpn分别感染HeLa、Hep-2、McCoy、HL和HIED细胞，发现Hep-2细胞的包涵体产量显著地高于其他细胞。国内余竹元等［9］ 对Hep-2、McCoy和HL三种细胞进行类似研究时也发现Hep-2细胞的包涵体产量高于另两种细胞。目前的主要问题是Cpn体外较难存活，实验室培养成功率相当低。一方面是由于Cpn本身的原因，另一方面，动脉