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关键词 乳牙 根尖周炎 根管 细菌
Microbial flora of infected root canals of human deciduous teeth with periapical disease
Wang Jun，Liu Zheng，Li Mingyu
The9th Hospital Affiliated the Second Shanghai Medical University，Shanghai200011.
【Abstract】 Objective The aim of the study was to investigate the suspicious pathogens of both acute and chronic periapical disease by analyzing the bacteria composition of infected root canal of human deciduous teeth.Methods Twenty-eight deciduous teeth including15with acute periapical disease and13with chronic periapical disease were selected for the study.The bacteria of the pulp were isolated and identified in80%N 2 ，10%H 2 ，10%CO 2 and in90%N 2 ，10%CO 2 ，respectively.Results In total，199species were isolated and identified，and69.34%were obligate anaerobes，26.63%were facultative bacteria.The deference of frequency of obligate and facultaˉtive anaerobes between the teeth with acute or chronic periapical disease was significant.The percent of Prevotella melaninogenicum and Peptostreptococcus micros to the total cultivated bacteria were much higher in the teeth with aˉcute periapical disease than that in which with chronic periapical disease，and the deference was significant.（X 2 was equal to4.3919and13.9797respectively，P<0.05）.While it’s contrary to Veillonella，and the deference were sigˉnificant too（X 2 was equal to5.6502，P<0.05）.The deference of the percent of the other bacteria to the total cultiˉvated bacteria between acute and chronic periapical disease was not significant.Conclusion Prevotella melaninoˉgenicum and Peptostreptococcus micros may be have something to acute periapical disease，while Veillonella related to chronic periapical disease to some extent.
Key words human deciduous periapical disease root canals bacteria
乳牙由于解剖组织结构特点、饮食因素以及所处环境的影响容易龋坏，又由于自觉症状少，常发展成为根尖周炎，因此根尖周炎为儿童牙科的多发病、常见病，而细菌是引起根尖周炎的最主要因素。现已发现口腔内约有300多种正常居住菌，但它们能潜在地影响根管。已证实口腔微生物能通过多种途径进入髓腔，最常见的方法是通过龋坏及窝洞制备，打开大量的牙本质小管。能在牙髓腔内聚集的微生物约为牙本质小管直径的1/3，约0.5～3μm，如果环境为微生物的生长提供适宜的条件，这些微生物将在牙本质小管根管及根尖组织内生长繁殖。但细菌的聚集和生长受多种选择性因素影响，包括:营养、低氧化还原电势、细菌间相互作用、温度、PH、宿主反应、抗菌因素及抑制剂、微生物本身特性及它们所处的位置等。综观国内外文献报道，有关恒牙根尖周炎细菌学的研究较多，但乳牙根尖周炎细菌学的研究相对较少，而乳恒牙在组织结构上存在着诸多差异，这些又对其根管的细菌组成有一定的影响，因此本实验通过对乳牙急慢性根尖周炎感染根管细菌学的分析，揭示其可疑病原菌。
1 资料与方法
1.1 病例选择 选择就诊于上海第二医科大学附属第九人民医院儿童口腔科的初诊患儿中患乳牙根尖周炎、无全身性疾病、近1个月未服用抗生素者参与本试验，共28人，年龄4～9岁。依据病史、症状、临床检查及X线影像学检查将28人分为急性根尖周炎组和慢性根尖周炎组，其中急性组13例，慢性组15例。
1.2 样本采集 以棉卷+吸唾器隔湿，酒精棉球清洁牙面，2%碘酊消毒患牙及牙周组织，无菌牙钻开髓，充分暴露髓腔。对多根管牙仅从1只根管采样。为了减少根尖渗出液中细菌对试验结果的影响，试验中用无菌扩大针将根管冠1/3扩大致15 # ，无菌纸尖插入根管内放置30s，立即置于加有石蜡油的传送液中，送实验室备检。
1.3 微生物分离 将传送瓶置于旋涡振荡器上振荡1min，用传送液连续梯度稀释至10 -4 ，取10 -3 、10-4 两个稀释度的样本液0.05ml分别接种于TAS、MS、CFAT、L-Rogosa、KVLB、V-Rogosa、PS、FS、CDC平皿上，TAS、MS、CFAT、L-Rogosa在37℃微需氧培养48h，L-Rogosa、KVLB、V-Roˉgosa、PS、FS、CDC在37℃厌氧培养3～7天。然后观察并记录各平皿上菌落数、菌落形态，将每一菌落编号后进行次代培养。细菌的鉴定依据菌落形态、革兰染色、耐氧实验以及生化反应等。生化反应参考肖晓蓉的《口腔微生物学及实用技术》 ［1］及照经微机法筛选出的快速鉴定厌氧菌的生化指标 ［2］ ，用直接酶法进行鉴定。
2 结果
本试验共采集急慢性乳牙根尖周炎患儿28人次，均分离出细菌，共分离菌株199株，分属9个属。每只根管细菌种类1～7种，28人中23人（82.14%）为多微生物的混合感染，21人（75%）分离出专性厌氧菌，15人（53.57%）分离出兼性厌氧菌。根管分离株细菌分布见表1，在所有的分离菌株中专性厌氧菌占68.71%，最主要是消化链球菌（21.02%）、普氏菌（17.43%）、韦荣氏菌（10.77%）、梭杆菌（10.26%），而兼性厌氧菌占所有分离株的27.18%，其中放线菌10.26%，链球菌9.74%，乳杆菌7.18%。急性根尖周炎组细菌菌落形成单位为5.6×10 4 ～4.3×10 7 ，中位数为3.9×10 6 ，慢性根尖周炎组菌落形成单位为9.2×10 4 ～2.3×10 6 ，中位数为4.4×10 5 。
表1 急性和慢性根尖周炎患牙根管中细菌分布 （略）
表2列出了急、慢性根尖周炎组根管内各分离株占总分离株比例差异性比较结果，从中可以看出:急性根尖周炎患牙根管内专性厌氧菌和兼性厌氧菌的检出率与慢性根尖周炎相比，差异均有显著性;产黑色素普氏菌、微小消化链球菌。
表2 急、慢性根尖周炎组根管内各分离株差异性比较（略）
在急性根尖周炎组所占比例比慢性组高，差异有显著性（X 2 值分别为4.3919和13.9797，P<0.05），而韦荣氏菌则相反，差异亦有显著性（X 2 值为5.6502，P<0.05）。其它各菌所占比例在两组间差异均无显著性。
3 讨论
本试验发现:乳牙急、慢性根尖周炎患牙根管内均是以厌氧菌为主的混合感染，这与众多研究者报道一致，这主要是由于根管内环境对细菌生长存在选择性机制所致。无论乳牙或恒牙，无论其龋坏程度，其根管是个相对封闭的环境，随着炎症的进展，根管内营养、氧化还原电势等因素也发生一系列动态变化，有利于厌氧菌的存活和繁殖 ［3］ 。
但在28例根尖周炎患牙中，在所有分离株中专性厌氧菌占68.71%，比其他学者报道的低。T.Sato和Hoshino1993年报道从6颗乳牙坏死牙髓取样，经过严格厌氧培养、分离和鉴定，分离出422株细菌，其中专性厌氧菌占91% ［4］ ;而Sundqvist G等在需氧及厌氧条件下对患根尖周炎恒牙的感染根管进行采样、细菌培养、分离和鉴定发现:专性厌氧菌占总分离株的91.4%。这些结果的差异可能是多因素作用的结果，包括:样本差异、采样方法、培养时间、培养基类型、培养条件、染色方法等。与恒牙相比，乳牙硬组织薄、钙化度低，牙本质小管粗，龋蚀进展快;此外，乳牙时期的牙槽骨与恒牙时期的牙槽骨相比，硬骨板较薄，骨小梁较少，骨质钙化度低，易被破坏，这些都可能使得乳牙根管封闭性较恒牙差，其内氧张力较恒牙高，因此厌氧菌所占比例较低。本试验中专性厌氧菌在急性根尖周炎组所占比例比慢性根尖周炎组高，而在菌种方面，产黑色素普氏菌、微小消化链球菌在急性根尖周炎组所占比例比慢性组高，差异有显著性，这与许多学者的研究结果相似 ［3］ 。Sundqvist报道消化链球菌、弯曲杆菌、消化球菌、优杆菌、尤其是产黑色素普氏菌在急性根尖炎症的牙齿中检出率比无症状的牙齿高。Griffee等发现产黑色素普氏菌是牙髓坏死相关症状，包括疼痛、瘘道形成、臭味等的发生的主要病原菌。Baumˉgartner报告特异细菌，尤其是普氏菌、消化链球菌、梭杆菌与某些症状的发生密切相关 ［5］ 。此外，在本试验中，慢性根尖周炎组乳牙感染根管内韦荣氏菌占总菌的比例比急性组高，差异亦有显著性。据此我们认为产黑色素普氏菌、微小消化链球菌可能与急性根尖周炎的症状相关，而韦荣氏菌则与乳牙慢性根尖周炎有一定的关联。
在本试验中，兼性厌氧菌代表了根管中一重要的微生物群，放线菌占总分离株的10.26%，链球菌为9.74%，乳杆菌为7.18%在急性根尖周炎组和慢性根尖周炎间差异 无显著性。微需氧革兰阳性球菌和兼性厌氧菌在牙髓病变中起着重要的作用，它们与厌氧菌协同作用，在根管细菌聚集起主要作用。有文献报道感染根管内的感染部位易于聚集既有兼性厌氧又有专性厌氧的复杂菌丛，厌氧感染发生在低氧化还原电势的地方，这可能是由于血供差或是由于兼性厌氧细菌的先期感染。因此，根管是个复杂的环境，在这里一种细菌可能抑制或促进另一种细菌的生长，从而促进或抑制其临床特征 ［3］ 。
有研究证实链球菌在根管源性感染，包括急、慢性根尖周疾病中检出率较高。P.B.F.A Gomes等研究发现链球菌占感染根管中分离株的23.1% ［3］ ，尽管链球菌的确切毒性因子还未确定，但酶、代谢产物、肽多糖以及脂磷壁酸在这些微生物的感染过程中起着十分重要的作用。
在本试验中，无论患急性根尖周炎或慢性根尖周炎的乳牙，放线菌均有一定的检出率，尽管慢性组检出率比急性组的高，但二者间差异无显著性。而Jose F.Siqueira等用分子遗传学方法对54只恒牙感染根管中放线菌进行了检测，检出率为9.4% ［6］ ，与本试验结果（10.05%）比较接近;Pia Titterud Sunde等也对36例顽固性根尖周病损微生物进行了分析，9例（25%）发现了硫磺颗粒，而在其中7例的硫磺颗粒内分离、鉴定出放线菌［7］ 。由以上结果可以看出:无论乳牙或恒牙，无论初始感染或顽固感染，放线菌在根尖周感染中起着十分重要的作用。绝大多数放线菌毒性较低，进入组织中一般不足以导致感染的发生。但由于放线菌有菌毛结构，使得它能粘附于根管壁或其他细菌或宿主细胞，一方面它与宿主组织形成聚合体逃避宿主的防御，这种聚集体在与宿主组织保持平衡中生存，维持根尖周组织慢性炎症而不产生急性反应 ［6］ ，已知放线菌能在组织内长期生存而未引起宿主不适，一旦这种平衡被打破则有可能发生急性炎症;而另一方面它对根管壁或其它细菌或宿主细胞的粘附使得它比其它细菌更易躲开根管扩大、冲洗等机械作用，在根尖周组织内潜伏，导致顽固性根尖周感染 ［6］ 。因此，临床上治疗乳恒牙根尖周炎时，选择适当的药物控制放线菌的感染对治疗成功与否有着十分重要的意义。
参考文献
1 肖晓蓉.口腔微生物学及实用技术，北京:北京医科大学.协和医科大学联合出版社，1993，86.
2 汪俊，刘正.微机法对牙周病厌氧菌快速检测.上海第二医科大学硕士学位论文，1994.
3 G.Sundqvist.Ecology of the root canal flora.Journal of Endodontics，1992，18（9）:427-430.
4 T.Sato，E.Hoshino，H.Uematsu and T.Noda.Predominant obligate anaerobes in necrotic pulps of human deciduous teeth.Microbial Ecoloˉgy in Health and Disease，1993，6:269-275.
5 Baumgarter JC.Microbiologic and pathologic aspects of endodontics.Curr Op Dent，1991，1:737-743.
6 Jose F.Siqueira，Jr.，Isabela N.Rocas et al，.Actinomyces Species，Streptococci，and Enterococcus faecalis in Primary Root Canal Infections Journal of endodontics，2002，28（3）:168-172.
7 Pia Titterud Sunde，Ingar Olsen，Gilberto J.Debelian et al.Microbiota of periapical lesions refractory to endodontic therapy.Journal of Enˉdodontics，2002，28（4）:304-310.
作者单位:200011上海第二医科大学附属第九人民医院口腔预防儿童科
上海市口腔医学研究所