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【摘要】 目的 建立糖尿病部分基因检测方法。方法 高盐沉淀提取人白细胞糖尿病基因模板，用PCR两步法扩增片段，检测其碱基顺序排列技术。结果 所检测的正常人基因片段包括3243A●G和3316●A点突变与S.Anderson，A.T.Bankier，B.C.Barrell等人报道的人糖尿病基因编排序列一致。结论 本法与酚提取法、克隆序列检测等方法相比，时间缩短数成本降低。对糖尿病部分基因点突变研究和诊断提供了简便有效的检测方法。
关键词 糖尿病 基因 两步法 扩增 测序
对糖尿病病因和发病机制的研究中发现，部分糖尿病患者线粒体转运核糖核酸亮氨酸（即tRNA Leu（UUR） ）3243A●G和3316G●A点突变［1，2］。目前用于糖尿病基因检测主要是酶切方法。该法所用酶受点突变的严格限制，一种酶只能用于一种点突变。为此我们采用基因测序方法，建立了用蛋白酶K消化有核细胞，异丙醇提取，两步法扩增后直接测序的方法。经1年多的应用，结果满意，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 样本
白细胞样本取自本院门诊及住院糖尿病患者，对照组为血糖正常人。EDTA抗凝，样品在抽血后1h内分离白细胞，贮-20℃备用。
1.2 引物
上游为5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3′，下游为5′-GGCCTAGGTTGAGGTTGACC-3′，由中国科学院上海细胞生物研究所合成。
1.3 试剂
淋巴细胞分离液（上海细胞生物研究所提供）;细胞裂解液:10%SDS10ml，1M Tris-Hcl（pH8.0）5ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.4ml，加水到100ml混匀。5MNaCl。以上几种试剂临用前须高压灭菌。蛋白酶K2%，异丙醇。
1.4 PCR反应
反应总体积为50μl，内含模板5μl，10倍缓冲液（含Mg 2+ ）5μl，dNTP0.4μl，10×明胶5μl，引物各0.4μl，Taq酶2单位，双重蒸馏水33.8μl，加样后充分混匀。使用PE扩增仪2400型、4800型等需加液体石蜡油25μl覆盖，9600型则不须加液体石蜡。
测定方法:（1）有核细胞提取细胞分离液3ml，加抗凝全血3ml，3000rpm离心20min，吸中间白细胞层，用生理盐水洗涤两次，弃上清。（2）细胞裂解，加600μl裂解液，加蛋白酶K5μl，颠倒混匀至清亮后56℃3h。（3）提取DNA在上述混合液中加200μl饱和NaCl混匀，10000rpm离心10min。吸出上清液后加等量异丙醇（约500～600μl），颠倒混匀至DNA絮状沉淀，10000rpm离心10min，弃上清后加入1ml70%乙醇漂洗，沉淀干燥，加水约50μl溶解，作为模板。（4）扩增反应条件94℃预变性5min后，93℃1min65℃2min，30次循环，最后72℃延伸5min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。（5）序列测序由中科院上海植物生理生态研究所完成，测定仪为美国Beckman2000型。
2 结果
糖尿病基因PCR产物的测序结果的检测片段，从糖尿病基因3153到3610全长457碱基对排列如下: 3153TTCACAAAGCGCCTTCCC CCGTAAATGATATC-ATCTCA ACTTAGTATT 3201ATACCCACACCCACCCAAGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGAGCCCGGT3251AATCGCATAAAACTTAAAACTTTACAGTCA GAGˉGTTCAATTCCTCTTCTT 3301AACAACATACCCATGGCCAACCTCCTACTC CTˉCATTGTAC CCATTCTAAT3351CGCAATGGCA
所用方法检测正常人结果与S.Anderson，A.T.Bankier，B.C.Barrell报道的人糖尿病基因密码编排序列完全一致。3 讨论国外报道，线粒体tRNA Leu（UUR） 3243A●G点突变已被发现同世界上多个种族的2型糖尿病相关;tRNA Leu（UUR） 3316G●A点突变亦被发现同日本人群的2型糖尿病相关。我国已有作者对糖尿病线粒体tRNA Leu（UUR） 3243A●G和3316G●A突变在中国糖尿病人群中的发病情况进行研究 ［3～5］。但这些研究大多数都是用酶切方法检测。由于酶切方法对基因突变点非常特异，一种酶只能识别于某种突变，而对不同的突变点和突变方式，需用几种酶做几次才可能了解。重 要的是酶切法所用的内切酶不同产地和批号差异较大，故对结果影响较大。另外酶切法对基因排列无所了解，即使有其它基因突变、缺失也不能被发现。
序列检测由计算机控制完全自动化，酶切方法所用直接提取糖尿病NDA，用相同引物和扩增条件［3，4］，但经中科院上海植生所、常州市三院等单位测序，均不能测出序列。亦就是说绝大多数测定DNA方法由于纯度问题并不能直接用于序列检测。序列检测突变对DNA扩增产物的要求很高，能否测出及有无误报，取决于DNA的提取、扩增反应条件等测定方法及产物的纯度。
DNA经典提取法［5］，系采用酚、氯仿、异戊醇抽提，整个过程需数十小时以上。克隆序列测定，需将等位基因的PCR产物经低熔点琼脂糖回收纯化，然后经连接、转化、培养和提纯等步骤。我们根据Gerbitz KD和Odawara M的方法自行设计引物，并用重盐异丙醇抽提DNA，两步法扩增过程简单结果可靠。经一年多的应用结果满意，检测正常人对照和糖尿病基因未突变的病人基因密码与基因库完全一致。病人标本已发现1例基因突变正在近一步研究。随着大量DNA序列测定仪器进入临床，检测方法的进展和费用大幅度降低，基因测定应用越来越多，这对疾病的诊断和预防将起重要作用。我们所建立糖尿病部分易变DNA点突变检测方法无疑为常规序列检测起到抛砖引玉作用。
参考文献
1 Gerbitz KD，Gempel K，Brdieczka D.Perspectives in diabetes:mitochonˉdria and diabetes-genetic，biochemical，and clinical implications of the cellular energy circuit.Diabetess，1996，45:113.
2 Odawara M，Sasaki K，Yamashita K，et al.A G-to-A substitution at nucleotide Position3316inmitochondrialDNAisassociated with Japanses non-insulin-dependent diabetes mellitus.Biochemical and Biophysical Communications，1996，227:147.
3 萧建中，杨文英.线粒体转运核糖核酸亮氨酸基因异常与糖尿病.中国糖尿病杂志，1997，5（2）:78.
4 纪立农，侯晓梅.中国人2型糖尿病人群中线粒体基因突变的发生率及其临床特点的研究.中国糖尿病杂志，2000，8（2）:72.
5 谷志远.现代医学分子生物学，北京:人民军医出版社，1998，387.
（收稿日期:2004-07-20）
（编辑青 山）
作者单位:1226311江苏省通州市第三人民医院
2226001江苏省南通医学院附属医院