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Key words Proanthocyanidins from Seedpod of the Lotus（LSPC） KB cell apoptosis
恶性肿瘤是危害人类生命和健康的一种严重疾病。不少国家因恶性肿瘤死亡占三大死因（癌症、心血管病、脑血管）之首位。世界各国每年死于恶性肿瘤的人数约600万，而我国约有130万，1997年占成年死因的第一位。因此恶性肿瘤的防治已是世界性的保健问题。而口腔癌约占全部肿瘤的3% ［1］ ，口腔鳞状细胞癌是口腔最常见的恶性肿瘤，约占80%以上 ［2］ 。目前治疗癌症可采用手术、放疗、化疗和生物治疗，其机制是抑制癌细胞的生长或诱导其凋亡或死亡，也可能是几种机制同时起作用。
原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成的一大类酚类化合物。是迄今发现的天然抗氧化剂中抗氧化能力最强的一种。据报道原花青素对口腔癌 ［3］ 、皮肤癌 ［4，5］ 、乳腺癌 ［6～8］ 、胰腺癌 ［7］ 、前列腺癌 ［9］ 、肝癌 ［10］ 、肺癌 ［8，11］ 、胃癌 ［8］ 、结肠癌 ［6］ 等都有一定的预防或治疗作用。Hideyuki等 ［3］ 报道原花青素可诱导人口腔鳞癌细胞HSC-2及涎腺癌细胞HSG凋亡，其作用机制可能是通过激活casˉpase，使cytokeratin18发生降解从而促进凋亡;同时对正常龈成纤维细胞HGF具有保护作用。原花青素对其他癌细胞的凋亡作用未见报道。30多年来人们对原花青素特别是来自葡萄中的原花青素研究较为广泛，而关于莲房中原花青素的研究还是近几年的时间。本文研究莲房原花青素对口腔表皮样癌（KB）细胞的凋亡作用。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 人口腔表皮样癌KB细胞（中国科学院细胞库），莲房原花青素LSPC（本实验室制备，含量>98%），PI（上海长征医院提供），FITC-annexinⅤ（bender medsystems，Austria）。二氧化碳培养箱（Galaxy，Stephen Clark Fabrications Ltd，英国），EPICS-XL流式细胞仪（美国Coulter公司），JEM-1200透射电镜（美国）。
1.2 方法
1.2.1 PI染色法 由上海长征医院实验诊断科完成。待细胞在培养瓶中长至80%融合度，设置空白组和三个含LSPC组:200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，培养24h后，胰酶消化，PBS洗涤，酒精固定，PI染色，上流式细胞仪检测。
1.2.2 FITC-annexinⅤ/PI法 按试剂盒说明操作。待细胞在培养瓶中长至80%融合度，设置空白组和三个含LSPC组:200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，培养24h后，胰酶消化，PBS洗涤，然后将细胞重新悬浮在结合缓冲液中并调整浓度为（2～5）×10 5 /mL，取195μL细胞悬液加5μL Annexin V-FITC混匀常温孵育10min后，PBS洗涤并重新悬浮在190μL结合缓冲液中，加10μL浓度为20μg/ml的PI终止液，上流式细胞仪检测。
1.2.3 HE染色 ［12］ 在加盖玻片的培养皿中培养KB细胞，待细胞长至80%融合度，设置空白组和三个含LSPC组:200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，培养24h后，细胞按文献 ［12］ 方法进行染色。
1.2.4 透射电镜分析 由上海医科大学电子显微镜室完成。待细胞在玻璃培养瓶中长至80%融合度，细胞设置空白组和含300μg/ml LSPC浓度组，培养24h后，送至上海医科大学电子显微镜室完成。
2 结果
2.1 LSPC对KB细胞凋亡影响的PI染色法研究 细胞凋亡时在正常二倍体细胞DNA峰（G1峰）前出现一个亚二倍体峰（G0峰）。由图1可知，正常培养的KB细胞没有G0峰（图1:A）;当用含200μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h后，出现G0峰（图1:B），占总DNA含量的7.5%，即有7.5%的细胞发生凋亡;当用含300μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h后，也有G0峰（图1:C），占总DNA含量的8.3%，即有8.3%的细胞发生凋亡;当用含400μg/mL LSPC的RPˉMI-1640培养24h后，G0峰明显（图1:D），占总DNA含量的17.5%，即有17.5%的细胞发生凋亡。每个LSPC浓度设三个平行，随着浓度的增加，凋亡量也增加，组内间差异有显著性，且呈剂量效应关系。
2.2 LSPC对KB细胞凋亡影响的FITC-annexinⅤ/PI法研究 正常细胞FITC及PI均低染（FITC - PI - ），在流式细胞图上为1区细胞簇;早期凋亡细胞FITC高染而PI低染（FITC + PI + ），图上显示为4区细胞簇;死亡细胞FITC及PI均高染（FITC + PI + ），图上显示为3区细胞簇;2区亦为死亡细胞簇，与3区的区别在于2区为死亡的晚期阶段。由图2可知:正常培养的KB细胞活力良好，细胞都处在1区（图2:A）;当用含200μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h后，可见4区和3区分布有凋亡和死亡细胞（图2:B）;当用含300μg/ml和LSPC的RPMI-1640培养24h（图2:C）和用含400μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h（图2:D）后，细胞在1区出现大量的晚期死亡。说明在相同的条件下，低浓度LSPC对KB细胞作用显示凋亡形式，高浓度时为死亡方式。
2.3 LSPC对KB细胞凋亡的形态学观察 正常培养KB细胞HE染色在光学显微镜下可见细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色;凋亡细胞呈单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等;坏死细胞则呈均质红染的无结构物质，核染色消失 ［13］ 。由图3可见正常培养KB细胞生长良好，保持原有的生长形状，呈圆形和多角形，核浆比例大（图3:A）;当用含200μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h后，细胞跟正常培养基本一致，个别出现碎核（图3:B）;当用含300μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h后，细胞呈圆形，缩小，核固缩碎裂（图3:C）;当用含400μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h后，细胞膜严重皱缩，核染色质致密浓缩，出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体（图3:D）。表明KB细胞经LSPC作用后，HE染色，在光学显微镜下呈现出凋亡的典型特征。
2.4 LSPC对KB细胞凋亡的透射电镜分析 图4表明:正常培养KB细胞可见典型上皮细胞结构特征包括桥粒，微绒毛，张力丝等，核染色质呈均质分布（图4:A&B）。当用含300μg/ml LSPC的RPMI-1640培养24h后，可见细胞严重萎缩，桥粒结构消失，胞内出现大量的空泡，核染色质发生边集，核碎裂等。表明KB细胞经LSPC作用后，透射电镜下可见其凋亡的典型特征。
3 分析与讨论
细胞凋亡作为一种基本的生命现象，在维持机体自身稳定中起着重要的作用。它不仅存在于正常的细胞中，也存在肿瘤细胞中。肿瘤组织细胞坏死时组织周围有炎症反应，而凋亡时组织周围无炎症反应。故研究肿瘤细胞的凋亡作用有重要的生物学意义。
带有负电荷的染料PI不能使活细胞着色，当细胞被这些染料着染，提示凋亡细胞已到了较后期的阶段抑或细胞已经坏死 ［13］ 。细胞凋亡早期细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）从细胞膜内转到细胞膜外，可与标记有FITC的annexinⅤ特异的结合，PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中 ［13］ 。HE染色和透射电镜属于细胞形态学研究方法，具有简便、直观 等特点。从本研究可以看出，PI染色法结果表明，LSPC浓度在200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml时，G0峰分别占7.5%、8.3%、17.5%，提示有7.5%、8.3%、17.5%细胞处于凋亡后期或已经坏死或是两者的混合。FITC-annexinⅤ/PI法结果表明，当LSPC浓度在200μg/ml、培养24h后，部分KB细胞处于凋亡早期，当LSPC浓度在300μg/ml、400μg/ml时，部分KB细胞处于凋亡后期或已经坏死或两者都有。HE染色和透射电镜进一步证实，LSPC浓度在200μg/ml时、培养24h，可诱导部分KB细胞凋亡，并处于凋亡的早期阶段;随着浓度的加大，KB细胞凋亡量亦增加，相同的培养时间可使其处于凋亡的晚期阶段。四者结果统一，表明LSPC确实有诱导KB细胞凋亡作用。
（致谢:感谢上海长征医院实验诊断科仲人前主任等为本研究的完成提供场所。）
（本文图片见附页）（略）
参考文献
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（收稿日期:2004-05-17）
ˇ 基金项目:国家自然科学基金资助项目（编号:Z30270938）
作者单位:430070武汉华中农业大学食品科技学院
200003上海第二军医大学附属长征医院实验诊断科
（编辑青 山）