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【摘要】 目的 研究甲状腺细胞凋亡和凋亡相关蛋白Fas及Fas配基（Fas-L）的表达特征。探讨TH 1 /TH 2 细胞失衡及Fas介导的细胞凋亡与Graves病（GD）发病机制之间的关系。方法 用ELISA法检测30例GD患者治疗前后及32例正常对照组血清中各细胞因子及凋亡相关蛋白Fas及Fas配基（Fas-L）的浓度。发现Graves病患者治疗前TH 2 类细胞因子IL-4、IL-6、IL-10的含量明显高于TH 1 类细胞因子IL-2、IL-8、IFN-γ。治疗后明显下降（P<0.05）。GD患者Fas表达明显高于正常对照组（P<0.01）。而FasL在GD组轻度升高，与对照组比较无明显差异（P>0.05）。结论 GD患者TH 1 /TH 2 细胞平衡失调偏向以TH 2 占优势的免疫应答。其甲状腺细胞存在细胞凋亡和Fas系统的异常表达。提示Fas介导的细胞凋亡参与GD的发病过程。细胞因子IL-1β参与Fas的表达。
关键词 Graves病 自身免疫性 甲状腺疾病 白细胞介素 TH 1 /TH 2 细胞 细胞凋亡 Fas FasL
TH1/TH2of T cells and the apoptosis of Fas/FasL in patients with Graves disease
Wang Ying，Zhou Ning，Huang Yu，et al.
Dept of Endocrinology，Yan An Hospital，Kunming650051.
【Abstract】 Objective To investigate the role of the blood of Th1/Th2cells and apoptosis and Fas，Fas-ligˉand（Fas-L）expression in thyrocytes from patients with Graves disease（GD）and to explore the association of Th1/Th2cell and Fas mediated apoptosis with GD pathogenesis.Methods Cytokines and Fas Fasl in serumwere detected by ELISA in30patients with Graves disease（GD）befor and after compared with the control rates of Th2-like cyˉtokines（IL-4，IL-6，IL-10）gene transcriptions were much higher than those of Th1-Like cytokines（INF-r，IL-2，IL-8）（P<0.01）.Compared with hormal controls，GDthyrocytes showed a markedly higher of apoptosis Fas and Fasl.No difference existed in Fasl expression between GD and controls.IL-1βof cytokines was much higher than hormal controls.Conclusion Th2plays a predominant role in the pathogenesis of GD，in which the cytokines producˉtion is shifted toward the TH2type.There exist an apoptosis and Fas.FasLexpression in GD thyocytes，suggesting that Fas-mediated apoptosis participates in GD pathogenesis.Interleukin-1βparticipate in expression of Fas.
Key words Graves disease autoimmune Thyroid-disease interleukin TH1/TH2cells apoptosis Fas FasL
近几年的研究发现以IL-2、IL-8、IFN-γ为主的Th1细胞介导的细胞免疫，IL-4、IL-6为主的Th2细胞介导体液免疫应答。细胞凋亡（Apoptosis）是一种受细胞内特定基因操纵，调控的细胞自杀行为，在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维持正常组织和器官的稳定等方面均发挥重要的作用 ［1］ 。而凋亡相关蛋白FAS及其配基（FasL）介导的细胞凋亡在机体的生长发育、内环境稳态方面起重要作用。现已证实，Fas/FasL介导的细胞凋亡参与自身免疫性甲状腺疾病（AITD）的发病过程，尤其与桥本甲状腺炎（HT）患者甲状腺上皮细胞（TEC）的破坏密切相关 ［2］ 。Graves病（GD）是另一种常见的AITD，其发病机制主要涉及到体液免疫及细胞免疫的异常。本课题旨在对GD患者T细胞Th1/TH2亚群介导的免疫及外周血中Fas/FasL介导的细胞凋亡双重因素进行研究，从免疫和细胞凋亡水平探讨GD的免疫病理及发病机制。
1 对象和方法
1.1 对象 （1）正常对照组32例（HD）组:男12例，女18例，年龄（31.5±10.8）岁，均为本院健康体检者。（2）GD组:所有患者第一次就诊时均有典型的高代谢症候群的症状（疲乏、怕热、多汗、脾气暴躁、心悸、手抖等）。甲状腺肿大、突眼，结合甲状腺功能测定及甲状腺B超来确诊。其中30例为初诊患者，为GDa组，未经任何抗甲状腺药物治疗，病程0.6±0.8年。另30例用抗甲状腺药物（他巴唑或丙基硫氧嘧啶）治疗至少半年以上，为GDb组，病程3.6±1.8年。两组年龄（32.2±9.80）岁。排除合并有其它自身免疫性或感染性疾病，也排除有任何心、肝、肾等重要脏器功能异常者。
1.2 方法 所有受试者早空腹抽新鲜血5ml，标本1500r/min离心5min后取上清，无菌分装，置-20℃冷冻待用。各种细胞因子的检测采用ELISA法。检测62例GD患者治疗前及经用抗甲状腺药物（丙基硫氧嘧啶或他巴唑）治疗10～18周，临床症状缓解，甲状腺激素测定各项指标恢复正常后和正常对照血清中Fas、FasL、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、INF-γ的含量，试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供，按说明书操作。Fas试剂盒批内cr2.35%批间cr3.81%;细胞因子试剂盒批内cr2.62%，批间cr3.06%;TT 3 ，TT 4 ，FT 4 ，TSH，甲状腺球蛋白抗体（TGAb），甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）的测定采用放射免疫法，药盒由深圳拉尔文股份有限公司提供，严格按操作顺序，由专人负责。仪器由国营二六二厂提供，型号为XH-6010r放射免疫计数器测定。
1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS10.0统计软件，实验数据用ˉx±s表示，治疗前后比较采用自身对照检验。 GD组与正常健康对照组比较采用独立样本的t检验。
2 结果
2.1 表1显示IL-4，IL-6及IL-10各细胞因子在甲亢组明显高于正常组（P<0.01）治疗后明显下降（P<0.05）。而IL-2、IL-8、TNF-γ、IL-12等细胞因子在甲亢组轻度升高，治疗后变化不大（P>0.05）。
2.2 表2显示Fas在甲亢组明显高于正常组（P<0.01）。而治疗后Fas明显下降（P<0.05）。FasL在GD组轻度升高，但治疗后与甲亢组比较差异无显著性（P>0.05），Th1与Th2及Fas与FasL的表达程度呈正相关（Pearson列联系数分别为0.759，0.798，P<0.05）。
表1 GD组和正常对照组血清中细胞因子指标的比较 （略）
表2 GD组和正常对照组血清Fas、FasL及甲状腺激素水平比较 （略）
3 讨论
近年来，细胞因子在自身免疫性甲状腺疾病中的作用受到人们越来越多的关注，尤其是T细胞Th 1 /Th 2 亚群的划分，加深了人们对这类疾病免疫紊乱发生的新认识。IL-2、IL-8、IL-12、IFN-γ主要由Th1细胞产生，可增强自然杀伤细胞（NK）的细胞毒性，激发迟发性超敏反应，主要介导细胞免疫应答。IL-4、IL-6、IL-10主要产生于Th2细胞，促进IgG1、IgA、IgE等抗体的产生，介导体液免疫应答。 正常情况下Th1和Th2彼此相互抑制，处于动态平衡状态，维持正常的细胞免疫和体液免疫功能。Th1和Th2平衡在自身免疫性甲状腺疾病中被打破，Th1和Th2分泌的细胞因子在表达量上的比值能够反映机体总的免疫倾向。GD是器官特异性自身免疫性甲状腺疾病，其发病与促甲状腺素受体（TSH-R）抗体的产生密切相关。TSH-R抗体模拟TSH的作用而过度刺激甲状腺滤泡细胞，导致甲状腺功能亢进。TSH-R抗体属于IgG1亚类，Th2型细胞因子可促进IgG1亚类的产生，故推测GD发病可能以Th2型细胞因子为主，其免疫应答以体液免疫为主。Kocjan ［3］ 等检测来自GD患者和健康对照者外周血单核细胞培养液中细胞因子的滴度，发现与健康对照者相比，GD患者单核细胞培养液中IL-12明显减少，IL-10和IL-4明显增加，Th1和TH2分泌的细胞因子的比值明显降低，提示GD患者中细胞因子趋向Th2型。另外kallman等 ［4］ 检测了GD患者血液中细胞因子的滴度，对IFN-R/IL-4、IFN-2/IL-10的比值进行了分析，也显示Th2型细胞因子的产生高于Th1型细胞因子，总的免疫趋向Th2型。但Miyauchi等 ［5］ 的研究却得到相反的结论，他们发现GD患者血清IL-12、IL-8明显升高。因此认为Th1型细胞因子可能在GD中起重要的调节作用。本实验中IFN甲亢组IL-6、IL-4和IL-10明显增加，而IL-2、TNF-γ、IL-12、IL-8升高。治疗后IL-6、IL-4、IL-10明显下降（P<0.05），而IL-2、IL-8、IFN-γ、IL-12等细胞因子在甲亢组轻度升高，治疗后变化不大（P>0.05）。由Th2细胞产生的各主要细胞因子IL-6、IL-4、IL-10明显增加，而由Th1细胞产生的各细胞因子IL-2、TNF-γ、IL-12、IL-8升高不明显。所以本实验的免疫趋向支持Th2型。产生以上不同实验结果的原因可能是由于GD病程、采样时机、抗甲状腺药物及试验条件等不同引起。Fas抗原属于肿瘤因子/神经生长因子受体家族广泛分布于活化的T、B淋巴细胞，成纤维细胞，内皮细胞及上皮细胞等多种类型的细胞表面。Fas-L属于肿瘤坏死因子家族，主要位于活化的T淋巴细胞、自然杀伤细胞以及视网膜、睾丸等免疫隐蔽区和某些上皮起源的细胞凋亡 ［6，7］ 。现已证实，Fas/Fas-L诱导的凋亡是细胞毒性T淋巴细胞发挥效应的主要途径。参与GD甲状腺细胞凋亡的过程 ［8］ 。Fas-L是否在GD表达一直存在争议，最近Hiromatˉsu等 ［9］ 用各种方法从蛋白质和核酸水平发现GD甲状腺组织及细胞表达Fas-L，并在离体条件下证实Fas-L的表达具有功能性，可诱导表达Fas的转染体发生凋亡，由此参与浸润淋巴细胞的清除过程。而武晓泓等 ［10］ 研究发现正常甲状腺细胞不表达Fas-L，故认为Fas-L在GD的表达可能是机体在病理情况下的一种代偿现象，可促进增生的甲状腺滤泡细胞及浸润的淋巴细胞发生凋亡，对机体产生有益的影响。
正常甲状腺细胞分裂较少，同时甲状腺细胞凋亡也较少。Graves病患者血中存在甲状腺刺激抗体（TsAb）。TsAb与促甲状腺激素（TSH）受体结合，模拟TSH的作用，引起甲状腺肿大及激素合成增加。Shimaoka ［11］ 等研究认为:Graves患者甲亢期Fas水平增高，而治疗后甲功恢复正常者Fas水平下降。虽然在Graves患者Fas与游离甲状腺素水平有关，但甲状腺功能减退患者及无痛性甲状腺炎甲功亢进者Fas水平正常。提示Fas变化不能用甲状腺激素水平的变化解释。此外Fas水平与TsAb活性显著相关。Graves病Fas水平的升高提示细胞内另一种形式裂解的Fas mRNA增加，这种mRNA可产生Fas，而细胞表面的Fas水平降低，甲状腺细胞表面的Fas减少可使甲状腺细胞增生，甲状腺肿大，B细胞表面Fas减少自身反应性B细胞发生凋亡减少，B细胞可进一步使TsAb产生增加 ［12］ 。而细胞因子可诱导正常甲状腺细胞的Fas表达。Giordano等研究发现正常的 甲状腺细胞几乎不表达Fas、IL-1β可诱导正常甲状腺细胞的Fas表达。其它细胞因子如IL-2、IFN-γ、IL-12则无此功能，FasL广泛存在于正常及HT甲状腺组织中。因此认为IL-1β介导的Fas表达在HT甲状腺细胞的凋亡中起重要作用，同时，Fas介导的细胞凋亡可能是HT甲状腺组织破坏的主要病理机制。
本实验结果显示Graves患者甲亢期IL-1β及Fas水平增高，而治疗后甲功恢复正常者两者水平下降。而FasL在GD组轻度升高，与治疗后及对照组比较差异无显著性（P>0.05）。提示细胞因子IL-1β可能参与甲状腺细胞的Fas表达。本研究表明，Graves患者由于甲状腺出现免疫功能紊乱，尤其是Th1/Th2细胞群的失衡，导致以Th2介导的体液免疫应答为主，激活病理性免疫反应，导致一系列的病理生理改变和免疫功能紊乱。而细胞因子IL-1β参与细胞Fas的凋亡。Graves病甲状腺细胞存在Fas系统基因的异常表达。依据上述结果，可以采用Th2型细胞因子或抗细胞因子单抗去抑制或逆转Graves病的免疫反应过程，为临床上Graves病的治疗开辟新的途径。而GD患者体内TSAA可部分抑制Fas介导的细胞凋亡，并且细胞凋亡还存在如bcl-2基因家族等影响因素，细胞凋亡在GD发病机制中的地位、作用及其调控机制尚待进一步深入研究。
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作者单位:650051云南省昆明市延安医院内分泌科
（收稿日期:2004-08-20）
（编辑黄 杰）