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【摘要】 目的 探讨位于维吾尔族人I型胶原α1链（COL1A1）第一个内含子内Sp1结合位点G→T碱基突变的基因多态性。了解该位点多态性与骨质疏松的关系。 方法 从150名随机人群抽取的维吾尔族人的外周血中提取白细胞基因组DNA，用PCR扩增其COL1A1基因片段，产物用限制性内切酶进行酶切消化过夜，电泳鉴定基因型。 结果 150例研究对象基因型经测定均为SS型，没发现Ss或ss基因型。 结论 维吾尔族人I型胶原α1链（COL1A1）Sp1结合位点不存在G-T突变或极其稀少，维吾尔族人骨质疏松与Sp1结合位点多态性不存在必然的关联性。
【关键词】 COL1A1 基因多态性 民族
Study of the polymorphism at the Sp1binding site of the collagen typeⅠalpha1gene（COL1A1）of the weiwuer nationality
Ran Jinwei，Deng Zhongliang，Huang Chaoliang，et al
The Second Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing40010.
【Abstract】 Objective To detecte the G→Tmutation at base1of intron1at the binding site of the Sp1tran-scription factor of the collagen type I alpha1gene（COL1A1）of the Weiwuer nationality.And investigate the relation-ship between the polymorphism and osteoporosis.Methods White blood cell genomes of venous blood were extracted from one hundred and fifty randomly people of the Weiwuer nationality.Genotype for this polymorphism was deter-mined by using PCR，overnight incubation with restriction enzyme，and electrophoretic analysis.Results All of these150people，s genotype is SS，we didn't find out other genotype.Conclusion The data indicate that the G-T poly-morphism do not existence at the Sp1binding site of the collagen type I alpha1gene（COL1A1）of the Han nationality，or it's rare.The polymorphism is not associated with osteoporosis.
【Key words】 COL1A1 polymorphism nationality
骨质疏松以骨量减少和骨微细结构异常为特征，它使骨脆性增加从而易于发生骨折。近年随着人口老龄化的加剧，老年性骨质疏松的诊断与治疗已引起人们的高度重视。对家系及双胞胎的研究表明有超过85%的骨矿密度差异是由遗传决定的 ［1］ 。Ⅰ型胶原是骨基质的主要成分，约占骨有机成分的80%～90%，由COL1A1和COL1A2编码。对维持结构完整及骨生物力学特性非常重要。Grant等 ［2］ 于1996率先提出Ⅰ型胶原a1链（COL1A1）Sp1结合位点存在三种基因型:SS（G/G）、Ss（G/T）、ss（T/T），骨质疏松与该位点多态性之间存在关联性。随后的大量研究也证实了这种关联性的存在。本实验就维吾尔族人Sp1位点多态性及其与骨质疏松的关系进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象 本研究从随机人群中抽取维吾尔族人150例（标本来自新疆医科大学附属第一医院），男64例，女86例，年龄范围16～87岁，除外骨代谢性疾病及1年内服用影响骨代谢药物史。
1.1.2 主要试剂 EZ-Resin Blood DNA Isolation Kit（上海申能博彩生物公司），UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工），限制性内切酶Van911（pflMI）及DNA Marker（MBI公司），琼脂糖（北方同正）。
1.2 方法
1.2.1 血液DNA的提取 抽取对象外周血2ml，EDTA抗凝，用EZ-Resin血液DNA提取试剂盒提取外周血总DNA。溶解于TE，-20℃保存备用。
1.2.2 RFLP-PCR、产物纯化及酶切 采用Primer Premier4.11进行引物设计，目的片段包括1415-1711的核酸序列（Genebank AF017178）。所选用引物序列如下:上游5′-TGTCTAGGTGCTGGAGGTTAGG-3′，下游5′-GGCGCT-GAAGCCAAGTGA-3′。采用25μl反应体系，扩增条件:95°预变性4min，95°变性40s，55°退火40s，72°延伸40s，35个循环，72°延伸5min。模板量约500ng，Taq酶2u，dNTP0.5μl（终浓度200um），引物1μmol/L，MgCl（25Mm）4μl。琼脂糖电泳确认产物为297bp的目的片段，产物进行纯化（未纯化产物进行酶切时发现会出现假阳性，经纯化后均能切断），然后用限制性内切酶Van911（pflMI）于37°酶切过夜消化16h（酶切位点:CCANNNN↓NTGG），如无Sp1位点G-T的点突变则电泳可见分别位于约169bp及127bp附近的两条带。否则只能看见297bp的PCR产物条带，即不存在Sp1位点G→T的点突变。以上电泳均用1.5%的琼脂糖。
2 结果
以外周血DNA为模板的PCR扩增片段经酶切后，其产物的琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，所有产物均能酶切完全，在约169bp及127bp附近分别有一条带（SS型），而未见不能切断（ss型）或不能完全切断（Ss型）的个例。该结果表明:维吾尔族人COL1A1基因只有SS基因型，无COL1A1基因Sp1位点G-T的点突变。
3 讨论
骨质疏松症的严重后果是导致骨质疏松性骨折，从而影响患病人群的生活质量。骨质疏松主要表现在脊柱和股骨近端，呈向心性分布，该部位受外界影响较小，受力较恒定，这表明其受一定内在因素的控制。有证据表明遗传是决定骨量的重要因素 ［3］ 。型胶原约占骨有机成分的80%～90%，是由两条COL1A1基因编码的a1链和一条COL1A2基因编码的a2链组成的三螺旋结构。Grant等 ［2］ 发现在COL1A1转录调控区第一个内含子第一个碱基处的Sp1结合位点存在G→T的点突变，并提出骨质疏松与该位点多态性之间存在关联性 ［2］ 。此后有众多关于Sp1位点多态性的报道。McGuigan等 ［4］ 在2000年提出在I型胶原a1链的多个侯选多态位点中主要为Sp1结合位点多态性与骨质疏松相关。美国、英国、法国、捷克、丹麦、意大利、荷兰等国相关报道均认为该位点多态性是与骨质疏松密切相关的侯选基因。考虑到骨质疏松患病人群主要集中在老年女性中，Mirandola等 ［5］ 提出该位点的突变是老年女性骨丢失加速的标志，而不是低峰骨密度的标志。而瑞士、瑞典、芬兰、比利时、赞比亚等国家虽然发现有Sp1位点多态性，但并没发现其疏松相关。同是在高加索地区，Keen等 ［6］ 认为Sp1位点多态性与骨密度具有关联性，而Tao Chang等 ［7］ 通过研究却得出相反的结论，Han等 ［8］ 在韩国对200例韩国妇女的研究根本 没发现Sp1位点多态性存在。综合以上报道结果，从地域上来看似乎存在一种从西到东的地域过渡性。因此可以认为COL1A1基因多态性可能存在地域性或种族差异。通过本实验结果，我们认为:COL1A1基因Sp1位点多态性在维吾尔族人中不存在或极稀少。而结合目前临床上较大的骨质疏松症人群，可以认为对维吾尔族人骨质疏松起遗传决定作用的基因并非COL1A1基因Sp1位点的碱基突变。针对该位点多态性与骨质疏松关联性的不稳定性，可以推断COL1A1基因Sp1位点点突变对整个骨质疏松症人群可能只处于一种不恒定的次要决定性。而对于骨质疏松的遗传机制尚待进一步的研究。
参考文献
1 Ralston SH，Genetic markers of bone metabolism and bone disease.Scand J Clin Lab Invest，1997，57（Suppl227）:114-121
2 Grant SFA，Reid DM，Blake G，et al.Reduced bone density and osteo-porosis associated with a polymorphic Spl binding site in the collagen type I alpha1gene.Nat Genet，1996，14（2）:203-205.
3 Hustmyer FG，Peacock M，Hui S，et al.Bone mineral density in rela-tion to polymorphism at the vitamin D receptor gene locus.J Clin In-vest，1994，94:2130-2134.
4 McGuigan FE，Reid DM，Ralston SH，et al.Susceptibility to osteoporotic fracture in determined by allelic variation at the Sp1site，rather than Other polymorphic sites at the COL1A1locus.Osteoporos Int，2000，11:338-343.
5 Mirandola S，Sangalli A，Mottes M，et al.Rapid and efficient genotype analysis of the COL1A1Sp1binding site dimorphism，a genetic marker for bone mineral density.Molecular and Cellular Probes，2002，16:73 -75.
6 Keen RW，Woodford-Richens SFA，Grant SH，et al.Association of polymorphism at the type I collagen（COL1A1）locus with reduced bone mineral density，increased fracture risk，and increased collagen turnover.Arthr Rheum，1999，42（2）:285-290.
7 Tao Chang，Garnett，Sarah，et al.No Association Was Found between Collagen［alpha］ⅠType1Gene and Bone Density in Prepubertal Children.Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，1999，84（11）:4293-4294.
8 Han KO，Moon LG，et al.Lack of an intronic Spl binding site polymor-phism at the collagen type Ia1gene in helthy Korean women.Bone，1999，24:135-137.
（编辑黄 杰）
作者单位:400010重庆医科大学附属第二医院骨科
830000新疆医科大学附属第一医院检验科