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Nanjing University of TCM，Jiangsu210029.
【Abstract】 Objective To explore into the probable mechanism of Alzheimer's disease（AD）by the acupuncture treatment combined with DGSYS of TCM.Methods Three kinds of model rats with dysmnesia which were made by injected into drug of scopolamine or NaNo 2 in the abdomen separately and injured at the hippocampal CA 1 in brian by drug of quinolinic acid treated by single acupuncture or acupuncture combined with DGSYS of TCM or DGSYS of TCM were observed separately，to compare different influence on dysfunctions of acuquisition and consoli-dation of memory induced by drugs and injure with nimodipine（NM）or the normal rats.Results The group in which rats treated by acupuncture combined with DGSYS of TCM has better acquisition and consolidation of memory，which is significant difference.The possible mechanism is associated with the regulation of the glutamatergic function、im-provement of ability of the cholinerginic system and antioxidation、greatly antagonize the LTP inhibiting effects.Con-clusion The acupuncture treatment combined with DGSYS of TCM treating AD in clinic has certain scientific evi-dences and it is worth being popularized widely.
【Key words】 AD acupuncture/DGSYS/NM scop/NANO 2 glutamate/QA AchE/Ach NO/NOS SOD/MDA LTP
为了揭示针刺加当归芍药散治疗阿尔茨海默症（AD）能改善大脑智能发育和精神状态的症状及可能机制 ［1，2］ ，我们设计了3种不同实验性痴呆造模方案;进行了探索性研究，不竟获得满意的结果，现将资料整理如下。
1 实验材料
1.1 动物 选用健康5～9月龄灵活性较一致SD雄性大鼠150只，由南京中医药大学实验动物中心提供，体重290±10g。
1.2 药品及试剂 当归芍药散粉剂（DGSYS）江阴天江药业有限公司生产，批号:990820。尼莫地平（NM），山东新华制药股份有限公司生产，批号960405。氢溴酸东莨菪碱注射液（Scop），上海禾丰制药有限公司生产，批号960601，剂量0.3mg/ml。亚硝酸钠，浙江省兰溪市化工试剂厂，批号911113。QA、高丝氨酸、邻苯二甲醛（OPA）为Sigma公司产品，2-巯基乙醇系AMRESCO进口分装，其他氨基酸标准品和生化试剂为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 跳台及水迷宫测试（按中国医学科学院药物研究所DTT-2型跳台仪和SMG-2型水迷宫实验装置操作说明方法进行）。被动回避性跳台实验:药物造模10min（或术后第9天）后进行，24h后重作测试，各组动物交叉进行;手术造模，术后第10天再次测试。水迷宫空间分辨能力实验:各组大鼠手术后第11天在不同处理后1h进行，以进入盲端次数，到达终点所需时间及学会所需次数来衡量大鼠学习记忆能力。
2.2 实验动物分组及处理 随机分150只SD大鼠为5组，每组10只。其中针药组、针刺组用30#美容针于实验开始之日起，针刺“百会”穴（或“大椎穴”）和“肾俞”穴 ［3］ 。“百会穴”向前平刺3～6mm，“肾俞穴”稍向内斜刺5mm，捻转后，接G6805电针仪刺激10min，连续波，频率3Hz，强度2～4mA，以大鼠肢体抖动为度，每日1次，连续7天;针药组于针刺治疗前半小时灌服DGSYS溶液5.6g/kg，药物组于治疗前半小时灌服DGSYS溶液5.6g/kg，尼莫组于治疗前半小时灌服尼莫地平混悬液10ml/kg，模型组和空白组，自实验第1天起，与针刺组同样固定和处理，每次10min，连续7天为1个疗程。在QA损毁海马CA 1 区所致痴呆大鼠模型中，随机对照分为假手术组、模型组、模型+针刺组、模型+药物组和模型+针药组，模型组和假手术组大鼠自手术次日开始，与针刺组同样固定和处理，各组动物每日治疗或处理1次，连续15天为1个疗程。
2.3 造模方法
2.3.1 Scop所致痴呆大鼠模型 大鼠末次训练结束1h后除空白组外，均分别腹腔注射Scop2mg/kg，空白组腹腔注射等容量生理盐水。
2.3.2 NaNO 2 所致痴呆大鼠模型 操作同上，均分别给各组每只大鼠皮下注射亚硝酸钠混悬液120mg/kg。空白组腹腔注射等容量生理盐水。
2.3.3 QA损毁海马CA 1 区所致痴呆大鼠模型 实验大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg麻醉后，参照大鼠脑立体定位图谱 ［4］ 对双侧海马CA 1 区定位，用牙科打磨机钻开颅骨，将充灌2%滂胺天蓝醋酸钠溶液（0.5mol/L）的玻璃微电极插入至海马CA 1 区（AP-2.8mm，ML±1.0mm，DV3.0mm）通以阴极电流标记位置。用10%甲醛溶液灌流、固定脑组织后，取脑，连续冠状位冰冻切片，片厚50μm，中性红染色，显微摄影放大、观察定位。对另一组实验大鼠进行微量注射器垂直进针，以0.2μl/min的速度，将已配制的2μl QA溶液缓慢注入到海马CA 1 区，留针5min后缓慢退出，缝合皮肤，连续肌肉注射青霉素G钠［4×10 4 U/（kg·d）］3天，以防感染。假手术组用0.01mmol/L磷酸盐缓冲液代替QA注射于海马CA 1 区。实验室温度维持在22～24℃。
2.4 实验指标活性测定 氨基酸类神经递质HPLC荧光检测法。NO、NOS、SOD、LPO、蛋白质等试剂盒分别购自南京建成及聚力生物工程研究所，严格按操作说明分别测试。丙二醛（MDA）含量测试采用硫代巴比妥酸法，NO的代谢产物NO 3- 和NO 2- 含量用硝酸还原酶法。
2.5 数据统计处理 应用SPSS10.0统计软件，单因素方差分析（ANOVA）进行比较。
3 实验结果
3.1 Scop所致痴呆大鼠学习记忆的影响 ［5］
3.1.1 痴呆大鼠跳台测试 见表1。
表1 各组痴呆大鼠跳台测试参数比较 （略）
注:与模型组比较 * P<0.05， ** P<0.01，与尼莫、针刺组比较 # P<0.05
结果表明:模型组与空白组比较，测试错误次数明显增多及潜伏期明显延长，差异有非常显著性（P<0.01）。与模型组比较，针药组、针刺组与尼莫组测试错误次数均明显减少（P<0.05或P<0.01），潜伏期延长，差异有显著性（P<0.01或P<0.05），说明三组虽都可改善记忆获得障碍，而针药组与针刺组、尼莫组比较，潜伏期呈有意义的明显延长（P<0.05），说明针药组对改善Scop所致大鼠记忆获得障碍的作用较好。
3.1.2 痴呆大鼠水迷宫法测试 水迷宫法测试50只痴呆大鼠表明，模型组每天测试的错误次数明显多于空白组、针药组、针刺组、尼莫组（P<0.01或0.05）。治疗第一天时，针药组错误次数（3.8±0.84）、尼莫组（4.0±0.84）显著低于针刺组（5.4±1.14），P<0.05。处理后7天内，针药组错误次数仍然处于较低水平（P<0.05），同时登陆时间及游泳时间也缩短;而模型组登陆时间显著较长。这些结果均说明，针药组、针刺组、尼莫组可改善Scop所致大鼠空间识别障碍，针药组改善能力较单纯针刺组强，与尼莫地平作用相近（P>0.05）。
3.1.3 痴呆鼠大脑海马NO含量和NOS活性测定 见表2。
表2 5组大鼠NO含量、NOS活性及NOS/NO与迷宫训练登陆时间、错误次数的相关性（略）
注:与模型组比 * P<0.05， ** P<0.01，与针刺组比 # P<0.05
从表2中看出，模型组NO含量和NOS活性比正常组显著升高（P<0.05），也比其它各组显著升高（P<0.05或P<0.01），而模型组登陆时间也较其它各组明显延长（P<0.05、P<0.01），说明脑组织内NOS活性升高及NO过量生成与大鼠学习记忆障碍有关。从登陆时间相关分析中可见，NO含量越高的大鼠，其登陆时间越长，成绩越差。针药组减少NO生成和抑制NOS活性作用优于单纯针刺组（P<0.05），与尼莫地平组相似（P>0.05）。
3.1.4 学习记忆障碍痴呆鼠大脑皮层AchE含量和Ach含量测定 ［6，7］ 见表3。
表3 各组痴呆大鼠AchE和Ach含量变化 （略）
注:与模型组比 * P<0.05， ** P<0.01，与空白组比 △ P<0.05， △△ P<0.01
表3可见Scop痴呆大鼠皮层AchE活性显著增高，其余各组AchE活性均呈现下降趋势。与空白组比，模型组大鼠脑皮层Ach含量有显著下降，而其它组Ach含量均高于模型组。AchE/Ach的比值，模型组显著增加，针刺组可降低此比例，但仍未达对照组水平，而针药治疗组大鼠可显著下降至正常水平。
3.2 NaNO 2 所致痴呆大鼠学习记忆的影响
3.2.1 大鼠水迷宫试验测定 50只造模痴呆大鼠，针药组、针刺组、尼莫组每天平均登陆时间均较空白组缩短，在第5天训练末，针药组、针刺组、尼莫组分别在（12.75±4.06）s、（16.88±4.01）s、（13.38±5.29）s即可登陆，而空白组、模型组分别在（24.6±8.96）s、（20.88±16.88）s才能成功登陆，说明预防性治疗对正常大鼠学习过程也有明显促进作用。训练后皮下注射NaNO 2 药物造模后第2天（即第6天），与空白组比较，模型组登陆时间显著升高（P<0.01）。但随时间推移，模型组登陆时间仍居高，空白组、针药组、针刺组、尼莫组登陆时间逐渐缩短，较之模型组差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。而针药组较针刺、尼莫组差异亦有显著性（P<0.05）;对记忆巩固作用较针刺组更稳定。
3.2.2 NaNO 2 痴呆大鼠对大脑皮层LPO、SOD含量及活性的影响 见表4。
表4 NaNO 2 痴呆大鼠大脑皮层LPO、SOD含量及活性变化（略）
注:与模型组比 * P<0.05， ** P<0.01，与针刺组比 # P<0.05
表4中可见模型组LPO含量升高及SOD活性降低与针药组、针刺组、尼莫组比较差异具有显著性（P<0.05或P<0.01）;经治疗后，针药组与针刺组、尼莫组的LPO含量降低及SOD活性升高差异均有显著性（P<0.05），而尼莫组与针药组两组比较差异无显著性（P>0.05）。
3.2.3 SOD/LPO比值与各组学习记忆成绩相关分析 见表5。
表5 各组痴呆大鼠学习记忆巩固成绩与皮层SOD/LPO比值相关分析 （略）
注:与模型组比 * P<0.05， ** P<0.01，与针刺组比 # P<0.05
表5结果提示各组痴呆大鼠记忆巩固成绩与皮层SOD活性及LPO含量之比呈现相关性，即登陆时间越短，则SOD/LPO比值越大。而SOD/LPO比值是反映生物体内抗脂质过氧化潜在能力的一个重要指标和参数。
3.3 QA损毁海马CA 1 区所致痴呆大鼠模型 ［8］ 的影响
3.3.1 跳台实验结果 45只痴呆大鼠与假手术组比，模型组大鼠的反应时间和3min内错误次数明显增加，潜伏期明显缩短，表明QA注入双侧海马CA 1 区可损害大鼠的被动回避反应能力;而各治疗组反应时间和3min内错误次数明显下降，潜伏期明显延长。
3.3.2 水迷宫实验结果 37只痴呆大鼠中，可见QA注入双侧海马CA 1 区损害大鼠空间分辨反应能力，表现在进入盲端次数增加，到达终点所需时间延长及学会所需次数增多，而单纯针刺或用药可部分改善其空间分辨反应能力，针药结合对QA损毁双侧海马CA 1 区所致AD大鼠空间分辨反应能力障碍有明显改善作用（P<0.05）。
3.3.3 海马氨基酸递质含量测定 43只痴呆大鼠中，模型组大鼠的各种氨基酸神经递质均低于假手术组，其中Glu（3.51±0.30μmol/g组织）、γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA;2.90±0.26μmol/g组织）、甘氨酸（1.20±0.13μmol/g组织）含量下降显著;与模型组大鼠相比，三个治疗组的Glu、甘氨酸含量有不同程度的升高，其中针药组的Glu、甘氨酸（5.58±0.15 ※※ ，2.29±0.14 ※※ ，3.21±0.23 ※ μmol/g组织）含量显著高于针刺治疗组（4.25±0.17 △ ，1.38±0.13 ※△ ，3.32±0.22 ※※ ，μmol/g组织）和药物治疗组（4.91±0.28 ※※△ ，1.39±0.14 ※△△ ，2.80±0.10 △ μmol/g组织）。 （注:与模型组相比， ※ P<0.05， ※※ P<0.01;各治疗组与模型+针药组相比， △ P<0.01）
3.3.4 大鼠海马NO的含量和NOS的活性测定结果 43只痴呆大鼠中，模型组大鼠海马NO含量（2.31±0.52μmol/gpr）和NOS活性（5.63±0.87U/mg pr）均比假手术组（1.27±0.42 ※※ ，4.78±0.54 ※※ ）显著升高。而3个治疗组，尤其是针药组或显著降低造模大鼠NOS活性和NO含量（1.58±0.39 ※※ ，4.61±0.92 ※ ）。针药组NO含量低于针刺组（4.80±0.56 ※ 和药物组4.72±0.60 ※ ）。 （注:与模型组相比， ※ P<0.05， ※※ P<0.01，各治疗组与模型加针药组相比， △ P<0.01）
3.3.5 对造模大鼠海马SOD和MDA的影响 43只痴呆大鼠实验中，与假手术组相比（2.28±0.11 ※※ U/mg pr，1.65±0.11 ※ ，M/mg pr），模型组大鼠海马SOD活性显著下降（1.79±0.18U/mg pr），MDA含量明显升高（2.13±0.16），两者比值（0.91±0.15）显著低于假手术组（1.41±0.10 ※※ ）;而各治疗组的SOD活性比模型组升高，MDA含量下降，SOD/MDA比值升高。和针药组比（2.23±0.27 ※※ U/mg pr，1.23±0.08 ※※，M/mg pr，1.83±0.22 ※※ ），针刺组（2.61±0.17 ※※△△ U/mg pr1.63±0.15 ※※△△ M/mg pr，1.53±0.23 ※※△ ）和药物组的SOD和MDA（2.46±0.09 ※※△ U/mg pr，1.56±0.14 ※※△△ M/mg pr）增加，SOD/MDA（1.49±0.18 ※※△△ ）的比值降低。 （注:与模型组相比， ※ P<0.05， ※※ P<0.01，各治疗组与模型+针药组相比， △ P<0.05， △△ P<0.01）
3.4 对大鼠海马兴奋性突触后电位（EPSP）长时程增强（LTP）的作用 ［9］ 40只SD大鼠，随机分成对照组、电针组（大椎、双侧肾腧）、模型组（Scop痴呆大鼠模型）、电针加模型组，于皮层前穿质安装刺激电极，按Pellegrin图谱立体定位，引导并记录各组不同时间内，海马齿状回颗层的EPSP群发电位（PS）及强直刺激（HFS）诱发的LTP。结果提示，电针后诱发LTP与对照组相似，各参数值均优于对照组，时间超过2h，提示电针后对HFS诱发的大鼠海马LPT有显著的易化作用。而对氢溴酸东莨菪碱注射和随即电针后HFS，可显著对抗并翻转对氢溴酸东莨菪碱对LPT的抑制作用，与未电针的模型组比较差异有显著性，P<0.05～0.01。
4 讨论
阿尔茨海默症（AD）病因仍不清楚;由于其发病机制具有多样性、异质性、遗传性等特点，很难有理想动物模型进行机制研究 ［10，11］ 。国内外虽已探索出多种AD动物模型，包括转基因动物在内，但仍不能完全模拟、复制出AD主要病理、生化、神经递质和行为学等特征性变化，因而影响了AD发病机制和防治措施的进一步研究。为了能科学地证实我们前期临床研究的结果 ［1，2］ ，即针药治疗能明显改善和稳定AD患者近期记忆的衰退，复苏智能，并对预防复发、间接控制痴呆症状发展，有较显著的疗效。为此在本文动物实验机制研究中，同时采用了随机对照、系统观察针药综合治疗对3种不同类型痴呆实验造模大鼠（Scop、NaNO 2 所致的学习记忆障碍、药物QA损毁海马CA 1 诱发的痴呆动物模型等）学习记忆功能的影响和可能机制。实验结果表明，无论是跳台实验，还是水迷宫试验均显示，同样的针药治疗方法可明显提高各种不同痴呆造模大鼠被动回避反应能力和空间分辨能力，改善和增强其学习记忆功能;并能明显拮抗和改善东莨菪碱、亚硝酸钠、QA对大鼠空间识别记忆巩固的破坏，恢复其正常大鼠行为学表现。而单纯针刺或用药只能部分改善药物所致痴呆大鼠受损的学习记忆功能和行为学表现。在各实验中，还可见各模型组大脑皮层的LPO含量及各种自由基含量显著升高，而活性SOD等抗氧化酶活性则明显低于各治疗组，且其记忆巩固成绩也相应的显著下降，说明氧自由基反应在学习、记忆能力下降的过程中起了重要的作用。在各模型组研究中，治疗前后测试的乙酰胆碱、谷氨酸（glutamate，Glu）、SOD、MDA、SOD/MDA及NO、NOS等抗氧化指标、兴奋性突触后电位（EPSP）LTP实验参数显著改善，均有助于记忆障碍大鼠更好地复苏其受损神经元的功能。我们推测针刺可能在机体生理允许的极大调节范围内，在短时间内多途径、多层次、多靶点调节了机体内各种抗氧化酶及相关物质的活性，而中药则可能及时补充了因各种原因导致神经记忆细胞受损所减少的活性物质，二者相互补充，取长补短，相得益彰 ［4，8］ ，从而使针刺的效应被延长或增强，故针药综合的疗效优于单纯针刺或用药治疗。正如古人所云:若针而不灸，灸而不针，皆非良医也。针灸而不药，药而不针灸，尤非良医也。……知针知药，固是良医。这为临床应用针药综合治疗AD症提供重要的科学依据，并也为如何客观评估针灸、药物对痴呆疗效和机制的研究，提供了方法学上的新思路。
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* 基金项目:江苏省中医药管理局科研基金资助（编号:97010）
作者单位:210029江苏南京南京中医药大学
100100北京中国人民解放军北京军区总医院