大肠癌组织中VEGF、nm23和TP/PD-ECGF的表达和临床意义

　　【摘要】 目的  检测人大肠癌组织中血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤转移抑制基因nm23和胸苷磷酸化酶/血小板衍化内皮细胞生长因子（TP/PD-ECGF）表达情况，探讨三者与大肠癌预后的相关性及选择化疗方案的预测因素。 方法  应用免疫组化方法，对60例大肠癌患者癌组织中的VEGF、nm23和TP/PD-ECGF表达情况进行检测，并分析三者与大肠癌组织学分型、淋巴结转移、临床分期的关系，所有病例加用希罗达化疗。 结果  VEGF表达依大肠癌临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的顺序而明显上升（P<0.05），同时与大肠癌有无淋巴结转移密切相关（P<0.05）。VEGF阴性表达组患者nm23表达水平明显高于阳性表达组（P<0.05）。TP/PD-ECGF高表达组CR+PR率高于低表达组。 结论  TP/PD-ECGF可作为估计大肠癌预后、指导制定合理的个体化治疗方案的指标。nm23、可与VEGF、TP/PD-ECGF互补，作为判断大肠癌恶性程度、转移及预后的参考指标。
      
　　【关键词】  大肠癌 VEGF nm23 TP/PD-ECGF
    
　　大肠癌的治疗是以手术为主的多学科综合治疗。Ⅰ～Ⅱ期患者首选手术，术后酌情给予生物治疗或化疗。Ⅲ期虽然能够手术切除，但疗效不够理想。特别是有多组淋巴结转移患者手术难以完全切除干净，对延长患者生存期效果较差。癌症患者死亡的主要原因是术后复发和转移，血管生成癌症复发转移的主要原因 ［1］ 。血管内皮生长因子（VEGF）与肿瘤血管生成密切相关，是促进血管生成的众多因子中最重要的一种 ［2，3］ 。nm23是一种肿瘤转移抑制基因，研究表明其有抑制肿瘤血管生成的作用 ［4］ 。微血管生长是肿瘤发生、发展、转移的关键环节，胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）是促肿瘤微血管生长因子之一。该酶是嘧啶核苷合成分解过程中的重要酶，能将5-Fu前体药（如5-DFUR即希罗达）催化成5-Fu，同时它与血小板衍化内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF）是同一物质，是促血管生长因子之一，能够刺激内皮细胞生长和趋化。本实验采用免疫组织化学方法，检测术后大肠癌组织中的TP/PD-ECGF、nm23和VEGF、表达，探讨检测大肠癌组织TP/PD-ECGF表达作为估计大肠癌预后、指导制定合理的个体化治疗方案的指标。
    
　　1 资料与方法
     　
　　1.1 临床资料 60例大肠癌患者的手术切除标本，男38例，女22例;年龄29～68岁，平均49岁;部位分类结肠21例，直肠30例，肛管9例;组织学分类均为腺癌，其中乳头状腺癌22例，管状腺癌20例，粘液腺癌18例;病理分期以国际抗癌联盟制定的分期为标准，Ⅰ期10例，Ⅱ期18例，Ⅲ期32例。全部患者术前均未接受化、放疗。
   
　　1.2 检测试剂 VEGF兔抗人单抗（1:50）系Santa cruz公司产品;nm23抗血清（1:150）及所用二抗购自北京中山生物制品公司;ABC试剂盒为Vector产品。
   
　　1.3 检测方法 手术切除的新鲜组织标本，经4%福尔马林固定、石蜡包埋切片，采用常规HE染色法及免疫组织化学S-P法标记TP/PD-ECGF、VEGF、nm23。采用DAB染色，S-P试剂盒、TP/PD-ECGF单克隆抗体、鼠抗人CD34均购自北京中山生物试剂公司。操作严格按照产品说明书进行。用滴加PBS液代替一抗作阴性对照。VEGF以细胞膜及胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥10%为阳性表达，<10%为阴性表达;nm23以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥30%为高表达，<10%为低表达;TP/PD-ECGF判断标准:TP/PD-ECGF阳性物质主要定位于细胞质，呈黄色。TP/PD-ECGF表达阳性根据细胞染色强度和染色细胞所占百分数来判断。强度积分:不染色为0分;轻度染色为1分;中度染色为2分;强染色为3分。细胞比例为:无细胞染色为0分;<25%细胞染色为1分;25%～50%细胞染色为2分;>50%细胞染色为3分。若2项积分之和>2，则为TP/PD-ECGF表达阳性，≤2则为表达阴性。用SP/Envision染色法显色。
   
　　1.4 统计学方法 各组数据用ˉx±s表示，采用SPSS10.0版软件包进行统计分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果
    
　　2.1 VEGF、nm23表达与大肠癌组织学分型、淋巴结转移、临床分期的关系 参见表1，经统计学处理，VEGF、nm23表达二者在大肠癌各组织学分型间差异均无显著性（P>0.05）。而二者与淋巴结转移情况的关系则不同:N1（61%）、N2（75%）组VEGF表达明显高于N0组（28%）（P<0.05）;N1、N2组nm23表达均明显低于N0组（P<0.05）;另外，上述二者在不同临床分期间的表达差异均有显著性（P<0.05）。
   
　　2.2 TP/PD-ECGF的表达 TP/PD-ECGF主要表达于大肠癌细胞胞质和胞核，呈棕黄色至深棕色，间质细胞内多见。强阳性染色细胞多位于肿瘤浸润边缘。大肠癌组织阳性表达率71.7%（43/60），明显高于癌旁组织（31.6%，6/19）和正常大肠黏膜组织（5.6%，1/18，P值均<0.005）。本实验证实，大肠癌组织TP/PD-ECGF表达明显增高，以间质细胞为著。推测其机制为肿瘤间质中富含巨噬细胞，同时间质内大量的细胞因子或生长因子能增强TP/PD-ECGF的活性。强阳TP/PD-ECGF性染色的癌细胞大多位于浸润前缘，而此处正是肿瘤细胞浸润生长最活跃之处，提示TP/PD-ECGF可能与肠癌侵袭有关。

　　表1 VEGF和nm23与大肠癌临床病理关系（略）
   
　　2.3 临床疗效 60例晚期肠癌共接受希罗达化疗146周期。全部患者均经2个周期以上化疗，每例平均2.6个周期。CR6例，PR31例，NC16例和PD7例，总有效率（CR+PR）为61.7%（37/60）。TP/PD-ECGF高表达组CR5例，PR25例，NC9例和PD4例，总有效率（CR+PR）为69.8%（30/43）。中位缓解期9个月，中位生存期12个月，1年生存率为55%。TP/PD-ECGF低表达组CR1例，PR6例，NC7例和PD3例，总有效率（CR+PR）为41.2%（7/17）。中位缓解期8个月，中位生存期10个月，1年生存率为46%。性别、年龄、病理类型对疗效无明显影响。
   
　　2.4 临床受益率 全组有临床受益者共53例（88.3%），其中TP/PD-ECGF高表达组有临床受益者39例（90.7%），患者止痛药物的使用量减少或疼痛程度降低均>50%。治疗后的Karnofsky评分增加>20分以上者31例（72.1%），处于稳定状态中体重增加>5kg者8例（18.6%）。TP/PD-ECGF低表达组有临床受益者14例（82.3%），患者止痛药物的使用量减少或疼痛程度降低均>50%。治疗后的Karnofsky评分增加>20分以上者9例（52.9%），处于稳定状态中体重增加>5kg者1例（5.9%）。
    
　　3 讨论
    
　　大肠癌患者根治术后复发和转移是其死亡的主要原因。如何准确估计大肠癌患者根治术后复发转移的可能性，使其在复发转移前即得到及时治疗，是近年来临床研究的热点。传统TNM分期难以满足临床需要，随着大肠癌分子生物学和分子免疫学研究的进展，人们正设法寻找更有效的预测指标，其中VEGF、nm23表达及TP/PD-ECGF具有较重要价值。
   
　　大量研究表明，几乎所有实体瘤的生长和转移均依赖于肿瘤血管生成。新生的肿瘤血管不仅是癌细胞增殖、复发所必须的内部条件，也是癌细胞浸润和血行转移的第一路径。VEGF是一种多肽类细胞因子，也是促进血管生成的众多因子中最受关注的一种，与肿瘤血管生成密切相关。研究表明，VEGF除可诱导血管内皮细胞产生蛋白水解酶、间质胶原酶等促进血管生成外，还可提高血管通透性，促进血浆蛋白、纤维蛋白原外渗导致肿瘤间质水肿，为肿瘤浸润及转移提供条件 ［2，3］ 。本研究发现:60例大肠癌中40例VEGF阳性，阳性率高达66.7%。VEGF主要在大肠癌细胞浆内表达，尤其以癌组织周边及坏死区周围癌细胞的表达为强，这是缺氧刺激肿瘤细胞增加VEGF表达所致;复发和转移组VEGF阳性率高于无复发转移组，这是由于VEGF可促进大肠癌组织血管生成，这些新生的大量幼稚血管，缺乏完整性（无平滑肌），使癌细胞易侵浊血管，增加癌细胞入血机会，促进大肠癌复发转移;有淋巴结转移者VEGF表达率明显高于无淋巴结转移者，提示VEGF表达与肿瘤恶性程度呈显著正相关。
   
　　人类nm23基因是由Steeg等于1988年发现并命名，被认为是一种肿瘤转移抑制基因，早期研究显示其对癌细胞运动能力和转移潜能有抑制作用，人肺癌、肝癌和恶性黑色素瘤等的转移与nm23蛋白表达低下有关，但其作用机制尚不清楚，可能通过其蛋白产物二磷酸核苷激酶（NDPK）参于体内高能磷酸键转移，促进细胞分裂，参于G蛋白介导的信号传递，影响细胞内微管的聚合和解聚来影响肿瘤细胞的活性 ［4］ 。本研究显示:N0组nm23表达明显高于N1、N2组，表明nm23可抑制大肠癌淋巴结转移;nm23表达与VEGF表达呈明显负相关，提示nm23可能有抑制VEGF表达的作用。
   
　　TP是嘧啶合成分解过程中的一个重要的酶，与为同TP/PD-ECGF一物质。它能可逆催化胸腺嘧啶核苷为胸腺嘧啶和2脱氧-核糖-1磷酸，后者去磷酸化的产物2脱氧-D-核糖具有血管生成和催化内皮细胞活性。该酶在体外具内皮细胞催化性，体内有血管生成活性，是少有的具酶活性的促血管生长因子。其主要分布于人体血小板和胎盘，同时发现它在卵巢癌、大肠癌、胃癌等许多实体瘤中异常增高，其表达增高往往预示其预后不良。且TP/PD-ECGF与宫颈癌、食管癌、胃癌、肝癌组织中血管密度密切相关，TP/PD-ECGF不仅使肿瘤血管增生甚至可使肿瘤细胞凋亡减少，因而与肿瘤的浸润、转移相关。一般认为癌细胞增殖旺盛，核酸合成活跃，TP酶的活性高，故TP酶在肿瘤组织中异常增高，高于正常组织3～10倍 ［5，6］ 。希罗达（脱氧氟脲苷，5-DFUR）是5-Fu的前体物质，它在体内非常稳定，因其结构与胸苷、尿苷类似，在TP酶作用下才转化为5-Fu而发挥抗肿瘤作用［7，8］ 。由于TP酶具有特异的组织分配特性，即在肿瘤组织中的活性均高于正常组织，因此希罗达也在肿瘤组织局部分解活跃，从而显示出希罗达的选择特异性抗肿瘤作用 ［9］ ，同时TP酶与PD-ECGF为同一物质，而后者有促血管生长作用。据报道，肿瘤PD-ECGF与肿瘤微血管密度密切相关，且PD-ECGF可致肿瘤组织 微血管密度增加及肿瘤组织凋亡减少 ［10］ 。因此TP也是重要的肿瘤预后因子之一。希罗达在TP酶的作用下转化为5-Fu，发挥了双重功效，既减少TP酶活性，从而减少肿瘤血管增生，同时又抑制肿瘤细胞DNA合成。希罗达具有肿瘤化疗与抗肿瘤血管增生双重作用，为肿瘤治疗开辟一条新途径。因TP/PD-ECGF酶能增加5-Fu及其前体药化疗效果，故在TP/PD-ECGF酶表达增高的肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌等，应用5-Fu及其前体药具有确切疗效。故检测肿瘤组织中TP/PD-ECGF表达也是提示化疗有效的一个预测因素，能为选择化疗方案提供客观依据，具有重要的临床意义。
   
　　综上所述，我们认为:VEGF、nm23和TP/PD-ECGF三个指标相互补充，可作为大肠癌患者的预后指标，用于判断大肠癌恶性程度、估计复发转移和预后、指导制定合理的个体化综合治疗方案。
     
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　　作者单位:450008河南省肿瘤医院内科