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【摘要】 目的 本研究应用一种新的荧光分光光度法检测颞下颌关节紊乱病患者关节液中一氧化氮含量，探讨一氧化氮与颞下颌关节紊乱病的关系。方法 对77例颞下颌关节紊乱病患者，经临床及X线检查（包括双侧颞下颌关节开闭口位及患侧关节造影检查）分为三组：滑膜炎组、关节盘前移位组、骨关节病组。10名正常健康人作对照。采用改良荧光分光光度法检测下颌关节液中一氧化氮含量。结果 关节盘前移位与滑膜炎、骨关节病之间NO含量差异均有显著性（P＜0.05，P＜0.05）， 滑膜炎和骨关节病之间NO含量无明显差异。正常对照组有一例检测出微量一氧化氮（0.17μmol/L），明显低于患者组。结论 一氧化氮与颞下颌关节紊乱病病理改变有关，炎性病变比单纯结构紊乱一氧化氮含量高。改良荧光分光光度法检测一氧化氮灵敏度高、操作简单、技术先进。
【关键词】 一氧化氮；颞下颌关节紊乱病；滑液；荧光分光光度法
Measurement of NO content in synovia of temporomandibular disorders patients
CUI Jiang-tao，WANG Dong，CHANG Pan-hui.
Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China
【Abstract】 Objective To study the relationship between NO content and temporomandibular disorders (TMD) by improving fluorometric assay to measure NO content in synovia of TMD patients.Methods Chose 77 TMD patients randomly and divided them into three groups according to clinical examination and x-ray examination (panoramic transcranial views of closed mouth and arthrograpnic examination.): synovitis group， disc anterior displacement group， and osteoarthropathy group. Ten normal people as a control group.Measured NO content in TMD synovia with improved fluorometric assay.Results There are remarkable difference in NO contents between disc anterior displacement and synovitis， disc anterior displacement and osteoarthropathy（P＜0.05）.In control group， the NO content was more lower than the patients(one case:0.17μmol/L，nine case :0).Conclusion NO is relevant to pathological change of TMD， i.e. NO content is higher in inflammatory affection than that in simple structure disorder.
【Key words】 nitric oxide;temporomandibular disorder;synovial;fluorometric assay
一氧化氮（Nitric Oxide， NO）是一种自由基性质的气体，由一氧化氮合酶以L—精氨酸为底物的两个等价胍基氮之一，经5个电子氧化反应生成［1］。在生物体内作为重要的信使分子和效应分子。Mecartney-Francis等［2］在实验中发现NO可诱发骨关节炎，同时一氧化氮合酶抑制剂可减轻滑膜炎症和组织损害。为进一步研究NO在颞下颌关节紊乱病（temporomandibular joint disorder，TMD）中的作用机制，本研究采用一种新的荧光分光光度法检测正常人和TMD患者关节液中NO含量，探讨TMD与关节液中NO含量的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 天津医大第二医院2002年7月～2004年10月颞下颌关节门诊关节紊乱病患者77例（77侧关节），疾病分类标准采用马绪臣-张震康所提出的分类方法［3］。分为3组：第1组滑膜炎25例、第2组关节盘前移位27例、第3组骨关节病25例，正常对照组10例（见表1）。全部病例均行常规关节上腔穿刺，注入2ml无菌生理盐水，连续注入、冲洗、回抽5次，获得关节冲洗液置3000转/min，离心10min，取上清液-70℃保存，待测。
1.2 改良荧光分光光度法检测NO
1.2.1 标准品NO浓度测定 荧光分光光度法比色检测，RF-510荧光分光光度计（EX）365nm，带宽20nm；（EM）405nm，带宽5nm，Range X1，画坐标图1。
图1外标标准工作曲线 略
(1)外标标准工作曲线：NO2-浓度在25～100ng范围之内，呈良好线性（r=0.998）。
(2)回收率：对照标准曲线计算回收率结果为：95.5%～102%，平均值98.4%（n=10）。
(3)重复性：样品中加入已知量NaNO2（25ng）标准物按照样品预处理程序衍生，测10次荧光光度值，计算出变异系数为：CV=2.85。
(4)最低检出限（灵敏度）：按照上述方法检测标准品中NO2-最低浓度为25ng。
NO含量计算公式：NO(μmol/L)= (样品荧光值－空白管荧光值)/ （标准品荧光值－空白管荧光值）×标准品浓度×2/30(g/mol)
1.3 统计学处理 本文计量资料结果参数均以均值±标准差（x±s）表示，计数资料以用χ2检验表示。统计分析采用t检验及方差分析，两个指标间的相关性用两个变量的相关性检验。数据处理应用SPSS11.0统计学软件。
2 结果
2.1 各组一般情况比较 见表1。
表1 各组间一般资料比较 （略）
2.2 各组NO，VAS值比较 见表2，各组NO含量见图2。
表2 各组NO、VAS比较 （略）
图2 各组NO含量的散点图 略
3 讨论
NO在生物体内有着广泛的重要作用，是一种重要的细胞内信号分子，对多种器官、系统具有重要的调节功能。在我们的实验中发现颞下颌关节紊乱病患者NO含量均比正常对照组高，有研究表明类风湿关节炎和骨关节炎患者下颌关节液中NO含量升高［4］ ，我们实验结果表明正常对照组含量显著低于患者组；NO骨关节病组与滑膜炎组NO含量显著高于关节盘前移位组；而滑膜炎与骨关节病组NO含量差异无显著性。NO是由NOS以L-精氨酸和分子氧为底物，催化L-精氨酸的2个胍基氮之一，经5电子氧化反应生成NO和L-瓜氨酸。NOS作为生物体内NO合成的关键限速酶，对NO的合成及其生物功能的发挥具有重要作用。目前，已经确定的一氧化氮合成酶有神经元型（neuronal NOS，nNOS）、内皮型（endothelial NOS，eNOS）和诱导型（inducible NOS，iNOS）三种。
eNOS和nNOS称为原生型NOS，它们在血管内皮细胞及脑组织中被纯化出来，依赖于钙离子/钙调蛋白激活，起着维持细胞信号传递、调节血管紧张度及神经传递等重要生理功能［5，6］。iNOS在细胞因子如白介素-1（interleukin-1， IL-1）、肿瘤坏死因子-2（tumor necrosis factor-2， TNF-2）及干扰素等刺激下能产生。这种诱导发生在转录水平，是通过激活核转录因子（NF-κB）实现的［7］。一旦iNOS蛋白合成，它的活性是非Ca2+依赖型的，可持续表达，使NO水平升高，并可协同各种细胞因子增加软骨损害。TMD患者关节液中可检测出很多炎症因子如IL-1、TNF-2等，这些炎症因子可刺激iNOS产生，使关节液中NO含量升高。本组TMD患者多伴有不同程度的疼痛，滑膜炎组和骨关节病组NO含量比关节盘前移位组NO含量高，VAS值也相对高，这可能是因为NO可升高外周伤害感受器敏感性，其机制可能有以下3种：(1)NO使疼痛物质释放增多如PGE2。(2)NO抑制内源性抗伤害感受器物质作用于外周伤害感受器。(3)NO直接作用于伤害感受器。可见NO与TMD病理改变关系密切。
国内报道中正常人关节滑液中不能检测到NO［8］，但我们实验中发现正常对照组有1例检测出微量NO（0.17μmol/L），TaKahashi等［1］实验中也有一例正常对照中检测出NO，其原因为正常人滑膜细胞、成纤维细胞有iNOS表达，但含量很低，一般方法无法检测出，本研究首次应用改良的荧光分光光度法检测下颌关节滑液NO，灵敏度高，其最低检测限为25ng，此方法检测正常对照组有1例（1/10）滑液NO含量在检测线上。目前广泛使用的测定下颌关节液NO方法是Griess法，但灵敏度较低，干扰较多，操作复杂。荧光分光光度法具有特异性强，灵敏度高的特点，应用于组织液、口腔唾液、牙髓组织、血液中NO检测［9～11］，但下颌关节液中NO检测未见报道。本实验检测NaNO2标准品，NO2-浓度在25～100ng范围之内，呈良好的线性（r=0.998）（见图1）。标准品回收率为95.5％～102％，平均值98.4％ （n=10）。重复性试验CV=2.85。此方法灵敏度高，操作简便。
【参考文献】
1 TaKahashi T，Kondoh T，Kamei K，et al.Elevated levels of nitric oxide in synovial fluid from patients with temporomandibular disorders.Oral Surg Oral Med Pathol Oral Radiol Endod，1996，82:505-509.
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10 唐卫忠，林珠，段银钟，等.口腔唾液中一氧化氮的荧光分光光度法检测.牙体牙髓牙周病学杂志，1996，6（3）：129-131.
11 唐卫忠，彭玉田，林珠，等.正常人、龋病和牙髓炎患者牙髓组织中一氧化氮含量的检测分析.牙体牙髓牙周病学杂志，1997，7（3）：162-164.
基金项目：天津市自然科学基金资助项目(编号：023616611)
作者单位： 300211 天津，天津医科大学第二医院口腔科
(编辑：邓 锋)