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【摘要】 阴道毛滴虫是一种常见的性传播疾患病原体，可引起女性阴道炎、尿道炎和男性的尿道炎、前列腺炎等病症。近几年的研究表明，阴道毛滴虫的感染是引起女性宫颈癌、不孕不育的主要因素之一，并且是促进人类免疫缺陷病毒感染的因素之一。本病的诊断主要依靠实验室诊断，传统的湿片法由于其简便价廉，仍为大多数医院所采用，但其敏感性低。近年来，新型培养基及PCR技术的广泛使用，为阴道毛滴虫病的诊断提供了新的发展途径。
【关键词】 阴道毛滴虫；湿涂片法；培养法；PCR技术
阴道毛滴虫感染所致泌尿生殖系统疾病统称滴虫病(trichomoniasis)，它是重要的性传播疾病（sexually transmitted disease，STD）之一。研究表明：阴道毛滴虫感染是促进人类免疫缺陷病毒感染的因素之一；女性易引起阴道炎和尿道炎，妊娠期妇女如患阴道毛滴虫病会引起胎儿的宫内发育迟缓；滴虫感染也是男性非淋球菌性尿道炎(nongonococcalurethritis，NGU)的重要病因之一［1］。在临床上，许多妇女虽有感染，但却无临床症状或症状不明显；而男性无临床症状的比例比女性更高［2］。值得一提的是，这些带虫者将会导致配偶的连续、反复感染。因此，这就向临床医务工作者提出了如何提高诊断灵敏度的问题。近几年来，新的培养基及PCR等分子生物学技术的应用，亦为本病诊断建立可靠、快速、高效的实验诊断方法提供了新的发展途径。本文就该病的实验室诊断研究进展作一综述。
1 病原学诊断
1．1 湿涂片法和染色法 阴道分泌物生理盐水直接涂片法，也被称为湿涂片法，是目前临床应用较广泛的方法。本法通过观察活动的虫体，可快速做出诊断。但此法不仅会受温度的影响，也会受观察者主观因素的影响，故漏检率较高。涂片染色法也是阴道毛滴虫常用的检查方法之一，常用染色方法有吉氏或瑞氏染色法，也有人使用革兰染色法、papanicolaou-stained smears (PAP染色法，俗称巴氏染色法)、吖啶橙染色法等。言敢威等［3］认为，吉氏染液染出的标本虫体呈红色，而瑞氏染色的标本往往偏蓝色，两者鞭毛均难以着色，而用两者混合液染色的标本着色效果优于单一染色法。同时，阴道毛滴虫染色法还受染液的稀释度、缓冲液pH值、温度等多种因素影响，因此重现性往往不强。
1．2 培养法 培养法被认为是诊断滴虫病的“金标准”［4］，它较湿涂片法有更高的敏感性及特异性。实验中经常采用的培养基为液体培养基，有肝-胨-麦芽糖培养基、半胱氨酸-肝-胨-麦芽糖培养基和大豆-肝-胨-麦芽糖培养基等几种。耿志辉等［5］对这三种不同的液体培养基体外培养阴道毛滴虫的效果作了比较，发现滴虫在这三种培养基中的存活率和滴虫生长密度差异都具有显著性，认为半胱氨酸-肝-胨-麦芽糖培养基较适于阴道毛滴虫体外增殖。
在此基础上，赵建玲等［6］提出了用固体培养基培养阴道毛滴虫的方法，即在液体培养基半胱氨酸-肝-胨-麦芽糖培养基的基础上加上琼脂。培养发现，最佳条件为0.45%琼脂、37℃、厌氧箱培养、直径6cm的培养皿中接种100个虫体。由于培养基的制作比较费时，为了提高效率，许多公司生产了商品化培养基，如解脲脲原体培养基［7］，Diamond、Trichosel、InPouchTV培养基等。Borchardt等［8］比较了InPouchTv培养基与Diamond和Trichosel培养基培养阴道毛滴虫的效果，结果InPouchTV培养基检测的敏感性显著高于其他两种培养基。Chris L等［9］把268份标本分别同时用湿涂片法、PAP染色法、InPouchTV培养基和Diamond培养基培养法检测，以Diamond培养法作为“金标准”，湿涂片法、PAP染色法、InPouchTV培养法敏感度分别为36%、56%和81%，InPouchTV培养基培养法较湿涂片法的敏感度增加了2倍多。
在改进培养基本身的同时，也有一些学者把目光放在改进培养所使用的器皿上。刘合玉等［10］使用微孔反应板培养231例临床滴虫性阴道炎的疑似患者标本中的阴道毛滴虫，结果与常规培养基检测结果基本一致，阳性率达到70%。何春林［11］也使用此法培养阴道毛滴虫，结果显示：318份标本的阳性率为79.25%，与普通培养法的阳性率（75.79%）基本相符，且此法比普通培养法更方便、快捷。邓光贵等［12］用体积更小的毛细管作为培养器皿培养阴道毛滴虫，阳性率也和普通培养基相近。
2 免疫学诊断
2．1 ELISA法 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）虽敏感性好，特异性也高，但在诊断中需用可溶性抗原，抗原的标准化有待于进一步解决，且操作仍比较繁琐。但用阴道毛滴虫全虫抗原进行斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)，或用阴道毛滴虫的单克隆抗体进行ELISA试验(夹心法)，操作简单，不需特殊仪器，成为阴道毛滴虫检测的另一发展方向。
2．2 胶乳凝集试验 Carney等［13］学者通过阴道毛滴虫的培养，制备了纯化的全虫抗原，将自制的兔抗阴道毛滴虫抗体结合到聚苯乙烯胶乳微粒上，该胶乳试剂可与阴道毛滴虫的可溶性或不可溶性抗原发生特异性凝集，可用于阴道毛滴虫的快速诊断。
2．3 OSOM滴虫快速试验 Huppert等［14］使用OSOM滴虫快速试验技术检测阴道毛滴虫，这是一种免疫层析毛细试纸条法，可以在10min内检测出结果。在449份标本的检测中，OSOM滴虫快速试验的敏感性和特异性分别为83.3%和98.8%，而湿涂片法分别为71.4%和100%，此法相对于湿片法有较高的敏感性，且快速，有望提高阴道毛滴虫的检出率。
另外，用聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫印迹试验和双向凝胶电泳等方法，可鉴别阴道毛滴虫的不同虫株［15］。
3 分子生物学技术
3．1 PCR方法 自1992年Riley［16］等首次将PCR技术用于滴虫病诊断以来，又有许多学者设计出多种引物（表1），采用多种标本进行检测比较，逐步建立并完善了PCR诊断滴虫病的方法。
表1 PCR技术检测阴道毛滴虫常用引物（略）
Riley等［16］认为：引物TVA5和TVA6具有较好的应用价值；Madico G等［17］比较了三对引物检测23例确诊病例的结果，引物BTUB9-BTUB2、TVA5-TVA6、AP65A-AP65B的检出率分别是96%、61%和44%，引物BTUB9-BTUB2的敏感性比较高。不同的学者用相同的引物进行检测，结果不一致，就需要我们对这些引物做进一步的研究。
一些学者用这些引物与传统的湿涂片法和培养法作了比较。Riley等［16］用针对引物TVK3-TVK7的PCR技术和湿涂片法检测了428例疑似阴道毛滴虫感染的标本，54例（12.6％）PCR检测阳性，湿涂片法检测阳性仅26例（6%），且26例湿涂片法检测阳性其PCR检测亦阳性。Negm等［20］对23例有临床症状的标本做了检测，PCR技术、培养法以及湿涂片法检测的阳性率分别为91.3%、72.9%和56.5%，PCR检测阴性的标本用其他方法也未能检测阳性，这充分说明了PCR的敏感性。
PCR方法的优越性不仅在于其敏感性，而且它对女性患者标本的要求不如湿涂片法严格。湿片法和培养法常在阴道后穹隆取材，孕妇、儿童及青少年等不能接受，而且临床上一些早剥等情况下不能使用窥阴器，会引起胎儿早产，流产等现象。相比较PCR可以使用阴道拭子、阴道冲洗液、尿液或尿道拭子等作为检测标本，简化了标本的采集难度。
更值得一提的是阴道毛滴虫的检测不仅对于女性很重要，对于男性也很重要，男性的尿道炎、前列腺炎有时也会因阴道毛滴虫的感染而引起，并且一般无临床症状，Hobbs等［21］研究发现293例马拉维人中有51例(17%)患阴道毛滴虫病，其中有症状的为21%，而无症状的为12%。这往往会令大家忽视，从而容易传染给患者家属，引起不良后果。传统的方法对男性标本的检测有一定的局限性，而PCR方法则对男性阴道毛滴虫的检测有较高的敏感性。Schwebke等［22］用PCR检测有性传播疾病的男性尿液标本，并与传统方法比较，结果显示，湿片法检测的阳性率为5%，而PCR方法检出的阳性率为17%，且PCR方法对传统方法检测出的阳性标本有100%的敏感性。
3．2 荧光定量PCR 这是一种对阴道毛滴虫的DNA进行定量测定的方法。Hardick等［23］使用这种技术对253份尿样进行检测，并与传统PCR法相比较，敏感性和特异性分别为90.1%和100%，此法被认为是检测阴道毛滴虫较快速、准确、高效的方法之一。
3．3 荧光DNA原位杂交 Muresu等［24］用经生物素标记的探针（pROS21）和经异硫氰酸荧光黄标记的探针（pALE1）分别与临床标本进行原位杂交，在荧光显微镜下可见虫体的细胞核出现点状荧光，与阴道分泌物中的人体细胞、酵母以及细菌未出现交叉反应。用此法对临床标本的检测有一定的价值。
4 结论
对于阴道毛滴虫病来说，传统的湿涂片法的敏感性及特异性已经不能满足现今的检验要求，ELISA法、胶乳凝集试验等免疫学方法的应用可提高阴道毛滴虫的检测敏感性，随着新型培养基的进一步完善、PCR技术的标准化，为早期诊断、早期治疗阴道毛滴虫病提供了有利条件。
【参考文献】
1 Burstein GR，Zenilman JM. Nongonococcal urethritis a new paradigm. Clin Infect Dis，1999，28(Supp11)：566-573.
2 Der Schee C，Belkum A，Zwijgers L，et al. Improved diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swabs and urine specimens compared to diagnosis by wet mount microscopy，culture，and fluorescent Staining.J Clin Microbiol，1999，37(12)：4127-4130.
3 言敢威，彭先楚，付冉定. 阴道毛滴虫标本传统染色方法的改良. 湖南医科大学学报，2000，25(4)：370.
4 Lawing LF，Hedges SR， Schwebke JR. detection of trichomonosis in vaginal and urine Specimens from women by culture and PCR. J Clin Microbiol，2000，38(10)：3585-3588.
5 耿志辉，韩淑梅，刘利，等. 3种不同培养基体外培养阴道毛滴虫效果的比较.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2002，20（1）：42-44.
6 赵建玲，高兴政. 在固体培养基中培养阴道毛滴虫的研究. 中国寄生虫病防治杂志，2001，14（4）：274-275.
7 钱纪银.介绍一种阴道毛滴虫培养法.江西医学检验，2004，22（1）：85.
8 Borchardt KA，Zhang MZ，Shing H，et al. A comparison of the sensitivity of InPouch TV， Diamond’s and Trichosel media for detection of Trichomonas vaginalis.Genitourin Med，1997，73(4)：297-298.
9 Chris L，Ohlemeyer MD，Laurie L.Diagnosis of Trichomonas vaginalis in adolescent females：Inpouch TV Culture Versus Wet-Mount Microscopy.Journal of Adolescent Health，1998，22：205-208.
10 刘合玉，王培英. 用微孔板培养阴道毛滴虫.上海医学检验杂志，1999，14（1）：48-49.
11 何春林.微孔反应板培养法在阴道毛滴虫实验诊断中的应用.实用寄生虫病杂志， 2000，8（2）：58-59.
12 邓光贵，高海平，张文俊.毛细管微量培养法检出阴道毛滴虫.临床检验杂志，1998，16（1）：44-45.
13 Carney JA.New rapid latex agglutination test for diagnosing trichomonas vaginalis infection.J Clin Pathol，1988，41(3)：806.
14 Huppert JS，Batteiger BE，Braslins P. Use of an immunochromatographic assay for rapid detection of Trichomonas vaginalis in vaginal specimens. J Clin Microbiol，2005，43(2)：684-687.
15 高兴政，谭荣安.用聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳分析阴道毛滴虫滋养体抗原.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2001，19（4）：213-215.
16 Riley DE，Roberts MC，Takayama T，et al. Development of a ploymerase chain reaction based diagnosis of trichomonoas vaginalis. J Clin Microbiol，1992，30(2)： 465-472.
17 Madico G，Quinn TC，Rompalo A，et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis Infection by PCR using vaginal swab samples.J Clin Microbiol，1998，36(11)：3205-3210.
18 Mayta H，Gilman RH，Calderon MM，et al.18S ribosomal DNA-based PCR for diagnosis of Trichonomas vaginalis.J Clin Microbiol，2000，38：2683-2687.
19 Paola R，Angela M，Rocchigiani，et al. Sequence of cDNA coding for a 65kda adhesive protein for the specific detection of trichomonas vaginalis by PCR Microbiology letters，1995，129：21-26.
20 Negm AY， Haleem DA. Detection of trichomoniasis in vaginal specimens by both conventional and modern molecular tools. J Egypt Soc Parasitol，2004，34(2)：589-600.
21 Hobbs MM，Kazembe P，Reed AW，et al. Trichomonas vaginalis as a cause of urethritis in Malawian men.J Sex Transm Dis，1999，26(7)：318-387.
22 Schwebke JR， Lawing LF. Improved detection by DNA amplification of Trichomonas vaginalis in males.J Clin Microbiol，2002，40(10)：3681-3683.
23 Hardick J， Yang S， Lin S. Use of the Roche LightCycler instrument in a real-time PCR for Trichomonas vaginalis in urine samples from females and males. J Clin Microbiol，2003，41(12)：5619-5622.
24 Muresu R，Rubino S，Rizzu P. A new method for identification of Trichomonas vaginalis by fluorescent DNA in situ hybridization.J Clin Microbiol，1994，32：1018-1022.
(编辑：黄 杰)
作者单位：212001 江苏镇江，江苏大学医学技术学院寄生虫学教研室