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【摘要】 目的 探讨心血管病发病机制，有效地防治心血管病。方法与结果 一氧化氮（Nitric Oxide， NO）信号系统由一氧化氮合酶（NO synthase， NOS）、可溶性鸟苷酸环化酶（Soluble Guanylyl Cyclase， sGC）和cGMP组成。该系统在盐代谢、血管张力和血压调节方面发挥重要的作用。流行病学调查结果表明，高盐饮食是诱发高血压的危险因子之一，与原发性高血压的发病呈正相关。本文将从以下两方面进行研究： （1）低盐、高盐、L-Arg对SHR、WKY靶器官的影响。结果：SHR组在给予L-Arg后血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量都显著增高，而尿钠的排泄量变化不明显。对于SHR组，血压和尿钠的排泄量变化不明显，而血NO 和肾组织中cGMP含量明显升高。（2）采用RT-PCR技术，观察低盐、高盐、L-Arg 对WKY、SHR肾组织中sGC mRNA基因表达的影响。结果：L-Arg组，β1在WKY和SHR组均有明显的升高。结论 SHR组在给予L-Arg前，较对照组WKY的基础血压高；给予L-Arg后，血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量显著增高。提示我们：控制饮食中盐的摄入量对预防和治疗高血压病有显著疗效。
【关键词】 低盐；高盐；L-Arg；sGC；SHR；NO；cGMP；RT-PCR
心血管病是我国和全世界危害人类生命健康最严重的疾病之一，其患病率和死亡率均居各类疾病之首。探讨心血管病发病机制，从而更有效地防治心血管病是世界各国共同关注的重大问题。
高血压是一种独立的疾病，同时又是多种心血管病共同的危险因素，它可以诱发动脉硬化、脑卒中和心肌梗死，引起心肾等多种靶器官功能衰竭。研究高血压发病中与盐代谢相关的信号系统对揭示其发病机制、探寻有效的防治措施，均有重要意义。
一氧化氮（Nitric Oxide， NO）信号系统由一氧化氮合酶（NO synthase， NOS）、可溶性鸟苷酸环化酶（Soluble Guanylyl Cyclase， sGC）和cGMP组成。该系统在盐代谢、血管张力和血压调节方面发挥重要的作用。其中sGC 是NO重要的受体。Azam等应用连锁分析证实，sGC β亚单位基因是大鼠盐敏感高血压的相关基因。流行病学调查结果表明，高盐饮食是诱发高血压的危险因子之一。与原发性高血压的发病呈正相关。SHR大鼠由Okamoto和Aoki选育成功，SHR是一种遗传性高血压大鼠模型，其高血压的发病过程及主要病理变化与人类原发性高血压非常相似。本研究选用SHR和WKY大鼠为动物模型，给予高盐、低盐和L-Arg饲养，采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从mRNA水平研究了SHR和WKY大鼠在高盐、低盐和L-Arg因素干预下，其肾脏组织中sGC的表达水平，为高血压的临床治疗提供理论指导。
第一部分 高盐、低盐和L-Arg对SHR、WKY靶器官的影响
1 材料
1.1 药品 NaCl：市售分析纯；L-Arg：上海生物化学制药厂生产；磷酸二酯酶抑制剂（IBMX）：Sigma公司提供。
1.2 动物 10周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）和同龄同种系正常血压的京都种大鼠（WKY）各30只，体重200±18.2g，由中国医学科学院心血管病研究所实验动物科提供。喂养：高盐饮食组：给予高盐饮食，8% NaCl，分别用SHR-8%，WKY-8%表示；低盐饮食组：维持低盐饮食，0.45% NaCl，分别用SHR-0.45%，WKY-0.45%表示；L-Arg组：给予含2.25%的L-Arg的自来水饮用，分别用SHR-2.25%，WKY-2.25%表示。各喂养4周。
2 方法
2.1 监测指标
2.1.1 血压测定 取安静清醒状态的血压，作为基础血压。每周测血压1次。
2.1.2 尿Na+排泄量的测定 用电极法测定。
2.1.3 血NO的测定 采用尾静脉取血法，4周末可采用断头取血法。
2.1.4 肾组织cGMP的测定 采用上海中医药大学同位素教研室提供的cGMP放免试剂盒测定。
2.2 数据处理 应用SPSS统计软件。所有数据均以x±s表示。
3 结果
3.1 低盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响 见表1。
3.2 高盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响 见表2。
3.3 L-Arg对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响 见表3。
表1 低盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响 （略）
表2 高盐饮食对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响 （略）
表3 L-Arg对SHR、WKY大鼠的血压、尿钠排泄量、血NO、尿cGMP排泄量的影响 （略）
SHR组在给予L-Arg前，较对照组WKY的基础血压高。给予L-Arg后，在WKY组，血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量均显著增高，而尿钠的排泄量变化不明显。对于SHR组，血压和尿钠的排泄量变化不明显，而血NO 和肾组织中cGMP含量明显升高。
4 讨论
SHR是一种遗传性高血压大鼠模型，是研究高血压常用和理想的动物模型之一［1］。本实验的结果说明了L-Arg对SHR组大鼠的血压有控制作用。摄入L-Arg，可增加细胞内L-Arg的含量。L-Arg具有明显的降压降脂作用，并可抑制动脉粥样硬化的形成。当高血压时NO的量会减少，如果给予L-Arg，通过L-Arg逆转非对称性二甲基精氨酸对一氧化氮合酶（NOS）的竞争性抑制，提高NOS活性，恢复NO的生成量，增加EORP/NO合成和释放，起到扩张血管作用。一氧化氮是一种强烈的内源性血管扩张剂，可直接舒张血管平滑肌细胞，降低血管张力，并抑制平滑肌细胞的慢性增殖，保护内皮细胞的完整。调节心肌细胞的变力变时作用，参与中枢神经系统对心血管的调节，起到降低血压的效果。实验结果显示：用L-Arg后，SHR的HCY下降（P＜0.01），可能因为给予L-Arg恢复一氧化氮的生成，一氧化氮与HCY相互作用，形成无毒的S-亚硝基同型半胱氨酸可拮抗HCY增高时引起的毒副作用，减缓高血压血管病变的发生发展。高血压病致血管内皮受损伤后，其合成、释放的舒缩血管物质的功能也随之发生紊乱，其中最重要的NO和ET这一对相互作用、相互拮抗的舒缩血管因子。在体内NO是由NOS催化L-Arg和氧分子生成的，具有扩张血管、抑制血管平滑肌增殖和抑制血小板聚集的作用。
一氧化氮信号系统是由一氧化氮合酶、可溶性鸟苷酸环化酶和cGMP组成。NO有着广泛的生理作用，例如依赖内皮的血管舒张调节血管张力降低血压、抑制血小板凝集、抑制血管平滑肌增殖和促尿钠排泄等。在生物体内，sGC是NO重要的受体。NO的许多生理作用都是通过sGC生成cGMP介导完成的。该系统在盐代谢和血压调节方面发挥着重要作用。 L-Arg通过增加NO的释放量，纠正NO/ET的平衡紊乱以及改善肾功能而发挥降血压的作用。
第二部分 SHR在高盐、低盐及L-Arg干预下肾组织sGC mRNA的表达
1 材料
1.1 标本制备 实验处置4周末，对各组大鼠腹腔注射5%戊巴比妥钠35mg/kg，断头处死后，取双侧肾脏，用冰冷的生理盐水冲洗残余的血液，用滤纸吸干（在冰盘上操作），立即置于液氮内速冻，待转移到实验室后置于-70℃冰箱保存备用。
1.2 仪器 （1）高速冷冻离心机（上海市离心机械研究所）；（2）PCR仪（HYBAID EXPRESS）；（3）桥式水平电泳槽（北京东方仪器厂）；（4）电泳仪（EC-250）；（5）垂直电泳仪（Bio-Rad）；（6） 转移电泳仪（Bio-Rad）；（7）恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；（8）全自动数码成像系统及分析系统（英国SYNGENE公司GeneGenius系统）。
1.3 主要药品及试剂 （1）trizol一步法试剂、MMLV反转录酶、OLIGO（dT）15、核糖核酸酶抑制剂等：GIBCO公司；（2）TaqDNA多聚酶、dNTPs等：TaKaPa生物工程有限公司；（3）DMEM合成培养基（DMEM medium）:GIBCO公司；（4）琼脂糖（电泳用）：上海东海制药厂；（5）D-Hank's 液（g/L）:NaCl 8.00， KCl 0.40， Na2HPO4 0.06， KH2PO4 0.35；（6）50×TAE缓冲液：Tris碱60.5g，Na2EDTA·2H2O 9.3g，冰乙酸14.3ml，双蒸水250ml。
2 方法
2.1 RT-PCR检测 sGC mRNA表达 （1）引物的设计与合成：引物参考Human Genome Mapping central database文献设计，由博亚公司合成。β1扩增片断全长260bp。β2扩增片断全长400bp。GADPH扩增片断全长605bp。（2）提取RNA，合成 cDNA的第一链。（3）聚合酶链反应（PCR）。（4）PCR扩增产物的凝胶电泳和产物分析。
2.2 数据处理 结果用x±s表示，t检验进行统计学分析。
3 结果
从表4中可见正常饮食组sGC β1和β2的基因表达在WKY和SHY间差异无显著性（P＞0.05）；L-Arg组β1表达均有升高，WKY组基因表达高于SHR组（P＜0.05），而β2表达两组无差别；高盐饮食组β1的表达较正常组明显降低，β2明显升高，且WKY组高于SHR组（P＜0.01），而SHR组β2表达却高于WKY组（P＜0.01）；低盐饮食组较正常饮食组有所改变，但差异无显著性（P＞0.05）。SHR、WKY在高盐、低盐及L-Arg作用下肾组织中可溶性鸟苷酸环化酶mRNA基因表达。
表4 各组基因表达在WKY和SHY的比较 （略）
4 讨论
一氧化氮信号系统由一氧化氮合酶（NOS）、可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）和cGMP组成［1］。可溶性鸟苷酸环化酶催化三磷酸鸟苷（GTP）生成鸟苷酸环化酶（cGMP）。由于它是产生cGMP的两种酶之一（另一种为膜结合肽受体环化酶），所以sGC参与了许多重要的信号传导途径，特别是在心血管系统（如血管紧张度和血小板的功能调节）和神经系统（如神经递质传递）。SGC是由α、β亚单位组成的异二聚体蛋白，是一种血红素蛋白。SGC通过与NO结合而被激活。活化的sGC以及随后的cGMP浓度升高，使得NO/sGC信号向下传导，发生级联反应，从而激活cGMP依赖性蛋白激酶、cGMP门控型离子通道以及cGMP调控的磷酸二酯酶（PDE）。可溶性鸟苷酸激活后，促使GTP大量生成cGMP，cGMP和cAMP均为第二信使，通过靶蛋白起作用。其中NO/cGMP信使传导通路中有三个确定的靶向：cGMP依赖性蛋白激活酶、cGMP调空型磷酸二酯酶以及cGMP门控型离子通道。其一，对于cGMP依赖性蛋白激酶，其磷酸化靶蛋白随cGMP浓度升高而反应性升高。其二，环化鸟苷酸磷酸二酯酶催化、水解3-磷酸二酯酶-cAMP/cGMP，相应失掉AMP和GMP。其三，环核苷酸离子通道，是非特异性阳离子通道，存在与不同的组织（如视网膜和嗅觉上皮）。在生物体内，sGC是NO的重要受体，NO的生理作用如血管舒张、降低血压和促尿钠排泄等都是通过sGC生成cGMP介导完成的。作为联系NO和cGMP“纽带”的sGC，是一个异二聚体，由一个α亚单位和一个β亚单位构成。每个亚单位又有两种已知的同型异构体α1、β1、α2、β2［2］，而β亚单位在sGC的活性方面起决定性作用。
本实验表明，正常饮食的刺激低于β1/β2改变的阈值；而高盐饮食刺激大于β1/β2改变的阈值，同时在病变的自发性高血压大鼠反应更为强烈，与Ruetten H的报道一致［3］。在L-Arg组，β1在WKY和SHR组均有明显的升高，可能的解释为：sGC的调节活性与β亚单位两个异构体的构成比有关。实验发现，在α1/β2转染的COS7的细胞中，由 NO介导生成的cGMP仅为α1/β1转染的1/3，可以推测增加细胞中β2的表达，可降低接受NO激活的sGC活性［4］。研究发现，Dalh盐敏感大鼠肾脏中sGCβ2亚单位在mRNA和蛋白质水平的表达均增加，而β1亚单位基因表达减弱，提示Dalh盐敏感大鼠sGC对NO反应性降低，可能与其β亚单位基因水平的异常改变有关，即对NO不敏感的α1/β2表达增多和/或对NO敏感的α1/β1表达减弱。而对SHR和WKY的研究发现，在肾脏中sGC表达两者无差别。 一方面增加NOS合成NO的低物，提高NOS活性，从而增加NO 的合成和释放；另一方面，β1基因表达的上调，可增强接受NO激活sGC活性。两者共同作用下使肾组织中cGMP增加。通过PKG调节Na+-K+-ATPase活性，降低水、钠重吸收，还可通过抑制近曲小管Na+-H+交换，调节Na+-K+-ATPase以及降低肾小球前小动脉阻力血管的阻力而引起钠排泄增加，起到降低血压的作用［5］。对于高盐饮食组，恰好与L-Arg组相反，β1表达较正常饮食组明显降低，而β2表达则明显增高。从而降低sGC活性，cGMP生成量减少。同时，高盐饮食致高血压病者内皮损伤，血中ET浓度增加，NO浓度降低。以及肾脏损伤而致水、钠潴留，从而引起血压升高。低盐饮食组β1、β2表达对于正常饮食组有不同程度的改变，但无统计学意义，这表明在低盐组引起血压升高的因素中，β1/β2的改变不起主要作用［6］。
综上所述，β1/β2基因在不同刺激因素下的改变，可部分解释NO-sGC-cGMP系统与高血压之间的关系，对β1/β2在心、主动脉及脑等器官中随外界刺激因素改变有何变化，还需进一步研究。
第三部分 全文总结
一氧化氮（Nitric Oxide，NO）信号系统由一氧化氮合酶（NO synthase，NOS）、可溶性鸟苷酸环化酶（Soluble Guanylyl Cyclase，sGC）和cGMP组成。该系统在盐代谢、血管张力和血压调节方面发挥重要的作用。本文通过观察在低盐、高盐、L-Arg干预下，SHR、WKY靶器官的变化以及对肾组织中sGC mRNA基因表达的影响。
研究发现，给予L-Arg后，在WKY组，血压、血NO浓度以及肾组织中cGMP的含量都显著增高，而尿钠的排泄量变化不明显［7］。对于SHR组，血压和尿钠的排泄量变化不明显，而血NO 和肾组织中cGMP含量明显升高。正常饮食组sGC β1和β2 的基因表达在WKY和SHY间差异无显著性；L-Arg组β1表达均有升高， WKY组基因表达高于SHR组，而β2表达两组无差别；高盐饮食组β1的表达较正常组明显降低，β2明显升高，且WKY组高于SHR组，而SHR组β2表达却高于WKY组；低盐饮食组较正常饮食组有所改变，但差异无显著性，且无统计学差别。
这提示我们L-Arg可以通过NO-sGC-cGMP系统起到降低血压的作用。
【参考文献】
1 S-C Kuo， FY Lee， C-M Teng.United States Patent No，1996，5（574）:168.
2 T Ingi， J Cheng， GV Ronnett， Carbon monoxide: an endogenous modulator of the nitric oxide-cyclic GMP signaing system. Neuron，1996，16：835-842.
3 A Verma， DJ Hirsch， CE Glatt， et al. Carbon mo-noxide: a putative neural messenger， Science，1993，259：381-384.
4 R Zakhary， KD Poss， SR Jaffrey， et al. Targeted gene deletion of hems osygenase 2 reveals neural rose for carbon monoxide.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：14848-14853.
5 JR Stone， MA Marietta. Soluble guanylate cyclase from bovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectral characterization of the ferrous and ferristates. Biochemistry，1994，33：5636-5640.
6 JR Stone， MA Marietta. Synergistic activation of soluble guanyiate cyclase by'YC-1 and carbon monoxide； implications for the role of cleavage of the iron-histidine bond dur ing activation by nitric oxide. Chem Biol，1998，5：255-261.
7 A Friebe， G Schultz， D Koesling. Sensitizing soluble gua- nylyi cyclase to become a highly CO-sensitive enzyme.EMBO J，1996，15：6863-6868.
作者单位： 300162 天津，武警医学院附属医院
（编辑：齐 永）