HBV相关肝细胞癌患者HBV X基因变异的分析

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　　【摘要】  目的  分析乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相关肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者体内HBV X基因序列结构，判断HBV X基因变异与HCC发生有无相关性。方法  PCR法扩增HCC患者及其家族中HBV感染者血清HBV X基因，克隆并测序后对两组序列变异情况进行比较。结果  肝癌患者来源的HBV在HBx蛋白的T细胞表位、反式激活区、核心启动子区变异发生率较高，但与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。结论  HBV X基因变异可能与HCC发生没有相关性，有必要进一步加大样本研究。

    【关键词】  肝细胞癌；乙型肝炎病毒；X基因；聚合酶链反应；基因变异

       A study about mutations of X gene of HBV isolated from patients with HBV-related HCC

    XIANG Guangming,LI Tao,HE Dongquan,et al.Department of Digestion of Guangyuan City,Sichuan 628000,China

    【Abstract】  Objective  To study the structures of X gene of hepatitis B virus (HBV) isolated from patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and to find out whether there have relations between mutations of HBV X gene and hepatocarcinogenesis.Methods  HBV X genes were amplified from HBV DNA extracted from serum of HCC patients with positive HBsAg and their family members with positive HBsAg by polymerase chain reaction (PCR) respectively. The subgenomic frames were subjected to cloning and sequencing. Sequence results were aligned by BLAST and analyzed statistically.Results  HBV strains isolated from HCC have high-rate-mutations in T cell epitopes of HBx protein, transactivating domain of HBx and basal core promoter regions but have no statistical significance in contrast with that of control group (P＞0.05).Conclusion  The point mutations in HBV X region may not be associated with the development of HCC, but it's necessary to study further more cases.

    【Key words】  hepatocellular carcinoma；hepatitis B virus；X gene ；polymerase chain reaction；gene variant

    HBV X基因区全长465bp，编码含154个氨基酸的多肽，称为乙型肝炎X抗原(hepatitis B virus X antigen, HBxAg)。HBxAg不仅是病毒复制的调节蛋白，而且作为一种病毒癌基因，与肝细胞癌的发生密切相关［1］。但是，HBV X基因变异是否能够促进HCC发生，目前报道较少。本研究对HCC患者及其家族中HBV感染者血清HBV X基因变异情况进行分析，以便了解二者是否存在相关。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  试验组为肝癌伴HBsAg阳性患者9例，均为男，年龄24～52岁，所有肝癌患者均经病理学检查证实；对照组为肝癌患者家族中HBsAg阳性者11例，其中男6例，女5例，年龄19～48岁。所有纳入对象血清HBsAg均经ELISA法检测证实为阳性。留取血清2ml，保存于-70℃冰箱。

    1.2  主要分子生物学试剂  PrimeSTARTM  HS DNA Polymerase 试剂盒，DNA Marker: DL 2000，限制性核酸内切酶：SacⅠ、 HindⅢ(均购于Takara大连公司)，胶回收试剂盒；大肠杆菌Top10感受态细胞，pBS-T质粒载体试剂盒，质粒小量抽提试剂盒(均购于北京天为时代公司)。

    1.3  引物  参照GeneBank中HBV基因组相应区域保守序列设计引物正向：GGAGCTCATCATTTCCAT

    GGCTGCTCGGCTGTG; (nt1365～ nt1390)；反向：GCGGGATCCATTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGCATG；(nt1839～nt1813) (由Takara大连公司合成)。

    1.4  实验步骤

    1.4.1  血清HBV DNA抽提  采用酚-氯仿法提取血清HBV DNA。

    1.4.2  PCR扩增  PCR扩增目的基因片段采用94℃预变性5min；94℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定（图1）。图1  PCR扩增HBV X基因琼脂糖电泳图谱

    1，3，4，6，7 HCC patients;2,5,8,9 control group;

    10DNA Marker1.4.3  PCR反应鉴定  PCR产物凝胶回收，加A反应后与pBS-T载体连接并转化大肠杆菌Top10感受态细胞，增菌后抽提质粒作PCR反应鉴定。

    1.4.4  序列测定  将带有重组质粒的菌液送交上海生工生物工程技术服务有限公司作序列测定：以ABI377自动荧光序列分析仪进行序列测定，测序引物分别为T3或T7通用测序引物。

    1.4.5  HBV X区变异分析  将各序列结果登陆GeneBank，进行BLAST检索，找出各编码区序列，利用DNAClub分析软件将测得的编码区序列翻译出氨基酸序列，以相应HBV标准株序列为参照，经对各样本相应编码区保守氨基酸(或核苷酸)序列分析，同一位点出现超过2株变异视为变异活跃位点。使用SPSS12.0统计分析软件对两组不同位点变异资料做统计学处理(四格表Fisher确切概率法)，得出结论。

    2  结果

    2.1  HBV X区DNA扩增及克隆  20份血清标本均扩增出约490bp含HBV X基因的片段。将各基因片段克隆于pBS-T载体，获得20个阳性重组克隆。以ABI377自动荧光序列分析仪进行序列测定。

    2.2  HBV X区编码氨基酸变异情况  见表1。在肝癌患者中，HBV X区基因突变致编码HBx蛋白氨基酸变异有：26R→C，30V→F，33P→S，36P/A→T，38P→S，变异率分别为88.89%、55.56%、88.89%、88.89%、88.89%,这些氨基酸位于HBx蛋白的B细胞表位［2］。103位T→M，116V→L，118T→K，119E→D，变异率分别为44.44%、44.44%、33.33%、33.33%，这些氨基酸位于HBx蛋白的Th细胞表位［2］(11AA～25AA、61AA～75AA、91AA～105AA、111AA～135AA)。此外，在HBx反式激活区［2］ (120AA～140AA)，也发现127V→I、129F→L变异，其变异率均为44.44%。在核心启动子区1762及1764位核苷酸双突变引起的130K→M、131V→I等“热点变异”在肝癌组中仅11.11％(1/9)，与既往文献报道差异较大［3,4］。在本研究中，肝癌组内核心启动子区1752G→A、1760T→A变异多见，其比例均达到44.44％，对照组仅为9.09％。上述所有位点变异与对照组相比差异均无显著性。 表1  HBV X区变异对照表 注：与对照组相比，*P＞0.05

    3  讨论

    HBV X基因编码的HBx蛋白与HCC发生关系密切已为众多研究证实。既往研究发现，羧基端缺失变异的HBx蛋白可增强原癌基因ras和myc的转化能力，而且失去了转录活化及抗增殖效应，这种自然发生的变异体可在肿瘤组织中产生，能参与肝细胞的恶性转化，可能在肝癌发生中扮演关键的角色［5］。刘晓红等［6］认为HBx羧基端缺失了40个氨基酸的突变体转染细胞比野生型HBx转染细胞显示促增殖能力明显增强，推测羧基端缺失变异的HBx蛋白取消了野生型HBx的反式激活功能和抗增殖效应。本研究结果未发现X基因内部删除变异，可能与未检测肝癌组织中整合的乙肝病毒有关，因为删除变异常在整合的乙肝病毒基因组中发现。

    HCC组中，在HBx蛋白的Th细胞表位之116、118、119、127位氨基酸变异与Hwang等［7］报道符合，但是包括核心启动子区的其他位点的变异与既往报道有较大差异［3，8，9］。总的说来，目前在HCC患者发现的HBV基因变异位点不尽相同，笔者在HCC组中检出的HBV X基因变异率与对照组相比，差异无显著性，提示这些点突变可能与肝癌发生没有联系，当然也不排除与研究的样本数过少有关。X基因变异是否影响HBx蛋白转录激活功能，与肝癌发生有无相关性，需要作进一步扩大样本的研究。

    【参考文献】

    1  Chi Tarn, Lin Zou, Ronald L, et al. Hepatitis B virus X protein activates the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in differentiated hepatocytes. J virol, 2002,76(19): 9763-9772.

    2  徐晓，陈婉南，郑大利，等. 肝细胞癌患者B和C基因型乙型肝炎病毒X蛋白的变异特点. 癌症, 2004，23(7): 756-761.

    3  林旭，徐晓，郑大利，等. 肝癌患者乙型肝炎病毒全基因组结构分析.中华肿瘤杂志, 2004， 26(4): 213-316.

    4  Shuang-Yuan Kuang, Peta E Jackson, Jin-Bing Wang, et al. Specific mutations of hepatitis B virus in plasma predict liver cancer development. PNAS, 2004，101(10): 3575-3580.

    5  Tu H, Bonura C, Giannini C, et al. Biological impact of natural COOH-terminal deletions of hepatitis B virus X protein in hepatocellular carcinoma tissues . Cancer Res, 2001，61(21):7803-7810.

    6  刘晓红，林静，曹晓哲，等. 乙型肝炎病毒X蛋白羧基端氨基酸缺失对肝癌细胞生物学行为的影响.中华医学杂志, 2005，85(12): 825-830.

    7  Hwang GY, Huang CJ, Lin CY, et al. Dominant mutations of hepatitis B virus variants in hepatoma accumulate in B-cell and T-cell epitopes of the HBx antigen . Virus Res, 2003，92(2): 157-164.

    8  Baptista M, Kramvis A, Kew MC. High prevalence of 1762(T) 1764(A) mutations in the basic core promoter of hepatitis B virus isolated from black Africans with hepatocellular carcinoma compared with asymptomatic carriers . Hepatology, 1999，29(3): 946-953.

    9  Kao JH, Chen PJ, Lai MY, et al. Basal core promoter mutations of hepatitis B virus increase the risk of hepatocellular carcinoma in hepatitis B carriers . Gastroenterology, 2003，124(2): 327-334.

     作者单位： 1 628000 四川广元，广元市人民医院消化科

    2 四川遂宁，遂宁市人民医院感染科

    3 四川成都，成都中医药大学附属医院

　　 (编辑：罗  彬)