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【摘要】 目的 探讨低能量激光照射联合龙葵多糖对荷肝癌小鼠免疫细胞的影响。方法 建立荷肝癌小鼠皮下种植瘤模型，将荷瘤小鼠随机分为5组，连续治疗10天后将小鼠处死。测量荷瘤小鼠的体重、瘤重、脾重,计算抑瘤率及脾指数；取外周血用流式细胞仪检测小鼠免疫功能。结果 低能量激光照射联合龙葵多糖组小鼠的抑瘤率及脾指数增加，外周血CD3+、CD19+ 、 CD4+/CD8+ 、CD16+32+值显著增加。结论 低能量激光照射联合龙葵多糖能增强机体免疫功能,抑制荷肝癌小鼠肿瘤的生长。
【关键词】 低能量激光照射；龙葵多糖；肝癌；免疫细胞
Effects of laser irradiation unite solanum nigtum polysaccharide on immune cells in tumor loaded mice
NIE Qiao-zhen, HAN Yi-lin, SU Xiu-lan.The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Inner Mongolia,Hohhot 010050,China
【Abstract】 Objective To study effects of low energy laser irradiation unite Solanum nigtum polysaccarides on immune cells in liver cancer loaded mouse.Method Established liver cancer loaded mouse model and divided randomly mice into five groups, Then executed mice after 10 days and measured the body weight、tumor weight and spleen weight，and compared difference with each other and calculated the tumor inhibitory rate and spleen index; Taking peripheral blood to detect immune function of mice with flow cytometry.Results Low energy laser irradiation unite Solanum nigtum polysaccharide could enhance the tumor inhibitory rate and spleen index; CD3+、CD19+ 、 CD4+/CD8+ 、CD16+32+ level of surrounding blood increased. Conclusion Low energy laser irradiation unite Solanum nigrum polysaccharide may obviously enhance immune function of the body and inhibit the growth of the liver cancer in mouse.
【Key words】 low energy laser irradiation；compound polysaccharide；liver cancer；immunological cells
用激光与具有抗癌活性的中药龙葵多糖联合作用来抑制小鼠肿瘤目前研究甚少。本研究从细胞及分子水平探讨激光联合龙葵多糖对免疫细胞活性的影响，从而为抗肿瘤生物治疗研究开阔新思路。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验药物的配制 龙葵多糖：用200mg纯度为100%的龙葵多糖溶于50ml生理盐水中，过滤除菌，4℃ 保存。5-氟尿嘧啶（fluorouracilum ,5-Fu）：0.25g/10ml，南通制药总厂生产。
1.1.2 细胞株 肝癌细胞H-22由北大肿瘤研究所引进。
1.1.3 实验动物 昆明种小白鼠50只，内蒙古大 学动物实验中心购买。认证号：SCXK(蒙)2002-0001。鼠龄为4～5W，体重18～22g，雌雄各半。
1.2 实验方法
1.2.1 肝癌细胞系复苏培养 将肝癌细胞H-22复苏, 收集细胞放入1ml生理盐水中混匀，并等分两份，取2只小鼠，每只腹腔注射0.5ml肝癌细胞进行培养，1周后取小鼠腹水制备模型。
1.2.2 制备小鼠皮下荷瘤模型 取肝癌小鼠腹水约10ml，用生理盐水按1∶2稀释成细胞悬液，调节细胞浓度为2.5×1 07个/ml，按0.2ml/只接种于小鼠右腋皮下，将50只小鼠随机分为5组：(1)NS组：0.5ml/(只·天)灌胃;(2)低能量激光照射组：激光照射小鼠10min/(只·天)、剂量25.48 J/cm2 /(只·天)。(3)龙葵多糖组：2mg/0.5ml/(只·天)灌胃;(4)低能量激光照射联合龙葵多糖组：激光照射小鼠10min/(只·天)、剂量25.48 J/cm2 /(只·天)、龙葵多糖2mg/0.5ml/(只·天)灌胃;(5)5-Fu组：0.25mg/0.5ml /(只·天)灌胃。
采用南京激光仪器厂产JD—Ⅲ型激光器，输出功率12mW，波长632.8nm，光斑直径0.6cm。从接种瘤细胞24h后(2)(4)组用激光照射小鼠脾区(脱毛)，激光照射距离30cm，每日1次，每次照射10min，同时各药物组相应灌胃给药，照射、给药10次结束后24h处死小鼠。
1.2.3 免疫功能的测定 从眼动脉取1ml血，流式细胞仪进行T细胞亚群及CD16+32+、CD19+活性测定。
1.2.4 测量荷瘤小鼠的体重、瘤重、脾重，计算抑瘤率及脾指数 抑瘤率=［(NS组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/NS组平均瘤重］×100%。脾指数=脾脏重(g)/体重(g)。
1.3 统计学处理 实验数据应用SPSS13.0软件统计，多组间比较采用方差分析,组间两组比较用q检验。
2 结果
2.1 抑瘤率 实验组与NS组比较平均瘤重明显减小，且联合组平均瘤重小于激光组和龙葵多糖组，抑瘤率高于激光组和龙葵多糖组，平均脾重、脾指数也明显高于NS组。见表1。 表1 各组小鼠瘤重量、抑瘤率、脾重、脾指数指标 (略）
2.2 激光、多糖、激光联合多糖组对小鼠免疫细胞的影响 NS组T细胞亚群中细胞比例异常，表现为CD3+明显减少，CD4+/CD8+比值下降，CD16+CD32+、CD19+也明显减少；而联合组的相应各项值明显增多，与NS组比较差异有显著性（均P<0.01），联合组CD3+、CD19+ 、CD4+/CD8+ 、CD16+32+值较激光照射组和龙葵多糖组也有所增多，差异有显著性（均P<0.05），而5-Fu组各相应值明显下降。见表2。 表2 流式细胞仪检测各组CD3+、CD4+/CD8+、CD16+32+、CD19+ 值 (略）注:与NS组相比，▲P<0.01;与激光联合龙葵多糖组相比，●P<0.05
3 讨论
多糖具有较好的增强免疫功能，抑制肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤生长的作用［1］。目前研究方向已由单独应用多糖转向多糖联合生物疗法、放疗、化疗等其他疗法治疗肿瘤。激光具有光、热、磁、压效应和生物刺激作用，可引起机体神经-内分泌-免疫调节网络的一系列变化，从而呈现出免疫调节效应［2］。肿瘤的发生、发展及转归与机体的免疫功能密切相关。改善肿瘤患者免疫功能低下，激发和增强宿主体内的免疫活性细胞是免疫调节剂抗肿瘤免疫的重要作用途径［3］。
外周血T细胞亚群是反映机体细胞免疫的指标，正常情况下，机体CD4+/CD8+比值处于相对平衡状态。当CD4+/CD8+比值下降甚至倒置被认为是细胞免疫功能抑制的表现［4］。本实验表明，NS组荷瘤小鼠免疫呈负调节状态，CD3+ 、CD4+水平明显降低，CD8+水平明显升高，CD4+/CD8+比值显著下降，其识别和杀伤突变细胞的能力下降，使肿瘤细胞逃逸免疫监视和免疫清除，从而有利于肿瘤细胞的生长、侵袭。联合组CD3+、CD19+、CD4+/CD8+ 值明显高于NS组，且较激光照射组、龙葵多糖组也有所提高。提示激光照射联合龙葵多糖能激活体内的免疫活性细胞，提高机体免疫功能，可能作用机制是低能量激光照射免疫器官脾区，其能量被生物组织吸收后产生光化效应及热效应，其热作用改善了局部组织的血液循环,使血管扩张,并使细胞膜通透性增加,能量供应相应增加,促进了淋巴细胞分化，使淋巴细胞增多。同时通过受体的参与，发生光致敏化，产生光照活化效应，使生物合成酶的水平提高，从而增强ATP的形成，提高细胞的载氧能力，增强细胞的有丝分裂，促进其增殖活化的过程［5］。
NK细胞在T细胞免疫启动过程中与巨噬细胞、粒细胞一起构成了细胞免疫系统的第一道防线，在宿主肿瘤很小时，NK细胞就发挥抗肿瘤作用。本实验激光照射联合龙葵多糖组瘤块重量明显低于NS组，抑瘤率显著提高，NK细胞明显增多，肿瘤生长被抑制。有研究表明激光照射使NK细胞内酶活性增强,合成和分泌大量α-TNF、γ-IFN等细胞因子,从而发挥较强的抗肿瘤效应［6］。
低能量激光照射联合龙葵多糖是一种较为有效的提高荷瘤小鼠免疫功能的生物反应调节剂，可以通过提高机体免疫功能，激发体内的免疫活性细胞，促进肿瘤细胞坏死、诱导肿瘤细胞凋亡，实现整体的抗肿瘤效果。
【参考文献】
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6 M. Mc gowan M, W Yu, JO Naim , et al. The effects of low level laser irradiation on IL- 2 release from CD4 T- cells. American Society for laser medicine and surgery abstracts. Laser Surg Med, 1996,suppl 8: 6.
作者单位：1 010050 内蒙古呼和浩特,内蒙古医学院附属医院理疗科（Δ中心实验室）
2 010059 内蒙古呼和浩特，内蒙古医学院组胚教研室
（编辑：石 岚)