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【摘要】 目的 通过5-氟脲嘧啶（5-Fu）、羟基喜树碱（HCPT）、r-干扰素（r-INF）联合作用和三种药单独作用对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡和抗增殖作用的比较研究，为临床制定胃癌的联合用药方案提供科学的实验依据。方法 用MTT比色法、原位细胞凋亡检测法（TUNEL法）及免疫细胞化学Ki-67染色法等进行研究。结果 MTT法检测结果，5-Fu在2～25μg/ml范围内，HCPT在0.5-50μg/ml范围内，r-IFN在1000～15000μ/ml范围内，各1/3单药浓度的三种药联合作用对胃癌MGC-803细胞株均有抑制生长作用，并表现出浓度依赖性关系；联合用药组与之对应的各单药组相比，其抑制率大多差异无显著性（P＞0.05）,但略提高联合用药组单药的浓度（未提高到单药浓度）时，其抑制率差异均有显著性（P＜0.01）。TUNEL法检测结果，三种各单药和各1/3单药浓度的三种药联合作用均能诱导胃癌MGC-803细胞凋亡，肿瘤细胞凋亡率（APO%）随药物浓度的增高而上升，显示明显的量效关系，当药物作用48h时APO%达高峰；联合用药组与之对应的各单药组相比，其APO%大多差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。增殖细胞核抗原Ki-67检测结果，三种各单药和各1/3单药浓度的三种药联合作用于胃癌MGC-803细胞株后，Ki-67阳性表达率随药物浓度的增高和时间的延长而减少，表现出浓度、时间依赖性关系；联合用药组与之对应的各单药组相比，Ki-67阳性表达率大多差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。结论 5-Fu、HCPT、r-IFN各单独作用和三种药联合作用对胃癌MGC-803细胞株均有诱导凋亡和抗增殖作用；联合用药组与之对应的各单药组相比，其诱导凋亡和抗增殖作用更明显，差异有显著性。因此，认为5-Fu联用HCPT和r-IFN是一种治疗胃癌的可行方案。
【关键词】 5-氟脲嘧啶；羟基喜树碱；r-干扰素；胃肿瘤；细胞凋亡；细胞增殖；Ki-67
Effect on inducing apoptosis and anti-proliferation of 5-Fu combined with hydroxycamptothecin and r-INF for MGC-803 cell line of gastric cancer
LI Ying-xiu，SUN Dong-zhi，JIN Ren-jun，et al.Depatment of Pathology and Medical Jurisprudence Medical College of Yanbian University, Jilin,Yanji 133000,China
【Abstract】 Objective Through comparative study that effects on inducing apoptosis and anti-proliferation of 5-Fu﹑HCPT and r-INFjoint action and three kind of medicines alone affect on MGC-803 cell line of gastric cancer to provide the scientific experimental evidence for institute association medication plan of gastric cancer on clinical. Methods To reasarch using MTT assay,the tdt-mediated dUTP biotin end labeling（TUNEL） method and immunocytochemistry Ki-67 staining method etc. Results MTT assay showed that in extent 2～25μg/ml of 5-Fu,0.5～50μg/ml of HCPTand 1000～15000μ/ml of r-IFN three kinds of single medicine and each 1/3 single medicine density joint action all had the inhibition action and displayed density dependence relationship on MGC-803 cell line of gastric cancer;the inhibition rate had not different significantly（P>0.05） among the combined group with the corresponding three kinds of medicines groups,but few elevated density of combined group （not to arrived density of single medicine） the inhibition rate had different significantly among them（P﹤0.01）.TUNEL assay showed three kinds of single madicine and each 1/3 single medicine density three kind of medicines joint action all can induce apoptosis on MGC-803 cell line of gastric cancer,tumor cell apoptosis rate（APO%） upgrade as density raise up and evidently displayde dose-effect relationship,the action came to mixmum at 48thhour;the APO% had different significantly （P﹤0.05 or P﹤0.01）among the combined group with corresponding single group.Ki-67 anti-proliferation test indicated the Ki-67 positive expression rate decreased as density raise up and time prolong and displayed density and time dependence effects after three kinds of single medicine and each 1/3 single medicine density of three kinds of medicines jointly do use in MGC-803 cell line of gastric cancer;the Ki-67 positive expression rate had different significantly（P<0.05 or P<0.01）among the combined group with corresponding single group.Conclusion 5-Fu﹑HCPT and r-INF each alone affect and three kind of medicines joint action all had effects of inducing apoptosis and anti-proliferation on MGC-803 cell line of gastric cancer;and in the combined group the effects of inducing apoptosis and anti-proliferation more obviously expreesed than corresponding single group and had different significanty among them.therefore to considered that 5-Fu combined with HCPT and r-INF are one kind feasible plan for treats gastric cancer.
【Key words】 5-Fu; HCPT; r-INF; gastric cancer; apoptosis; cell proliferation; Ki-67
目前恶性肿瘤的治疗仍以手术、化疗及放疗为主，近年来重视中医中药的治疗作用，开始用中西医结合治疗一些恶性肿瘤。另外，伴随现代分子生物学、免疫学与肿瘤生物学的飞速发展，正在兴起肿瘤的生物治疗。本课题联合5-Fu（西药）、HCPT（中药）、r-IFN（生物药）三种抗癌药作用于胃癌MGC-803细胞株，通过MTT比色法、TUNEL法及免疫细胞化学Ki-67染色法，比较联合用药与单独用药对肿瘤细胞的诱导凋亡和抗增殖作用效果，为临床制定治疗胃癌的联合用药方案提供科学的实验依据。
1 材料和方法
1.1 胃癌细胞株和主要试剂 人胃癌MGC-803细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供，本实验室多年冻存在液氮中，临用前复苏后进行实验。5-Fu为上海旭东海普药业有限公司产品，HCPT为湖北黄石飞云制药有限公司产品，r-IFN为深圳科兴生物制品有限公司产品，RPMI-1640为GIBCO公司产品，新生小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品，胰蛋白酶（Tripsin）为DIFCO公司产品，蛋白酶K为德国Boehringer公司产品，噻唑蓝（MTT）为美国SIGMA公司产品，TUNEL检测试剂盒为德国Boehringer公司产品，Ki-67检测试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品，其他试剂均为分析纯产品。
1.2 体外细胞复苏与培养 人胃癌MGC-803细胞株用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5%CO2条件下常规培养。胃癌细胞传代至生长旺盛，于实验前24h半量换液，用0.4%台盼蓝染色3min，观察活细胞。本实验所用的细胞活性均在98%以上。
1.3 实验分组及药物处理 实验随机分为4个组：分别为5-Fu组、HCPT组、r-IFN组及三种药联合用药组；每组又分为5个小组：1个对照组和4个实验组。5-Fu组：对照组不加药，实验组里分别加2、5、10、25μg/ml终浓度；HCPT组：对照组不加药，实验组里分别加1、3、6、12μg/ml终浓度；r-IFN组：对照组不加药，实验组里分别加1000、3000、10000、15000μ/ml终浓度；5-Fu + HCPT + r-IFN组：对照组不加药，实验组里分别加（2μg/ml+1μg/ml+1000μ/ml）/3、（5μg/ml+3μg/ml+3000μ/ml）/3、（10μg/ml+6μg/ml+10000μ/ml）/3、（25μg/ml+12μg/ml+15000μ/ml）/3终浓度作用于胃癌细胞。每个小组培养12h、24h、48h、72h，在4个时间段里观察细胞的变化。
1.4 药物毒性实验 采用MTT快速比色法，计算药物抑制率，同时获得50%抑制率（IC50）的浓度。
药物抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%
A值为490nm实验波长下测定的每孔的光吸收值。
1.5 生物化学TUNEL染色观察 实验操作按宝灵曼公司试剂盒说明书进行,并略加修正、染色后,在真彩病理细胞图像分析系统中求得凋亡细胞（TUNEL阳性细胞）。结果判断：在TUNEL染色中细胞凋亡阳性物质呈棕黄色,位于细胞核内，计算APO%,随机选取10个高倍视野,分别记数凋亡细胞和总细胞数,APO%=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.6 免疫细胞化学Ki-67染色观察 实验操作按S-P试剂盒说明书进行,并略加修正、染色后,在真彩病理细胞图像分析系统中求得增殖细胞（Ki-67阳性细胞）。结果判断：Ki-67阳性物质呈棕黄色,位于细胞核或细胞核和细胞质内。计算阳性表达率,每组随机取5个统计场,其平均值作为Ki-67的阳性表达率。
1.7 统计学处理 MTT法检测的抑制率之间的比较用χ2检验进行,Ki-67阳性表达率的组间平均率的比较用t检验进行。
2 结果
2.1 MTT法检测药物对胃癌MGC-803细胞株的生长抑制作用 5-Fu在2～25μg/ml范围内,HCPT在0.5～50μg/ml范围内,r-IFN在1000～15000μ/ml范围内,各1/3单药浓度的三种药联合作用,对胃癌MGC-803细胞株均有抑制生长作用,并表现出浓度依赖性关系;三种药联合作用组与之对应的单药组相比,其抑制率大多差异无显著性（P﹥0.05）,但略提高联合用药组单药的浓度（未提高到单药浓度）时,其抑制率差异均有显著性（P﹤0.01）。见表1～4。表1 5-Fu作用胃癌MGC-803细胞株48h时的抑制率注：ΔP﹤0.01表示与前一个浓度比较的P值表3 r-INF作用胃癌MGC-803细胞株48h时的抑制率注：ΔP﹤0.01表示与前一个浓度比较的P值（n=9）
2.2 TUNEL法检测药物对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡作用 三种各单药和各1/3单药浓度的三种药联合作用均能诱导胃癌MGC-803细胞凋亡,肿瘤细胞APO%随药物浓度的增高而上升,显示明显的量效关系,当药物作用48h时APO%达高峰,之后随作用时间的延长凋亡细胞逐渐减少,坏死细胞却逐渐增多;三种药联合作用组与之对应的各单药组相比,其APO%除部分时间、浓度间差异无显著性外,其余差异均有显著性（P＜0.05或P＜0.01）,但略提高联合用药组单药的浓度（未提高到单药浓度）时,其APO%差异均有显著性（P<0.01）（见图1）。
2.3 Ki-67染色检测药物对胃癌MGC-803细胞株的抗增殖作用 三种各单药和各1/3单药浓度的三种药联合作用于胃癌MGC-803细胞株后,Ki-67阳性表达率随药物浓度的增高和作用时间的延长而减少,表现出浓度、时间依赖性关系；联合用药组与之对应的各单药组相比,Ki-67阳性表达率在大部分时间、浓度间差异均有显著性（P＜0.05或P＜0.01）,当略提高联合用药组单药的浓度（未提高到单药浓度）时,其阳性表达率差异均有显著性（P﹤0.01）（见图2）。
3 讨论
恶性肿瘤的临床治疗中,化学疗法是最基本的治疗方法,但在临床化疗中常发现一些化疗药物的实际疗效不佳和对机体有较明显的毒副作用。因此,研究制定疗效好、毒副作用较小的联合用药方案很必要。5-Fu是目前对消化道恶性肿瘤化疗的首选药物，它是一种抗代谢药物，抑制肿瘤细胞DNA的生物合成，同时可通过诱导肿瘤细胞凋亡而使其主动性自杀性死亡〖1〗
捎诔鱿种琢鱿赴嘁┠鸵┬缘仍颍涫导柿俅擦菩Р焕硐耄⒕哂幸欢ǖ亩靖弊饔茫籋CPT能够抑制拓朴异构酶（ToPol）活性，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂和DNA复制，另外，众多研究表明ToPol抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡〖2〗
籸-IFN的抗肿瘤作用是多方面的，包括抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡作用及诱导多方面抗肿瘤的免疫应答作用〖3〗
硗猓魑锓从Φ鹘诩量稍黾?-Fu的抗肿瘤活性，调节肿瘤细胞对5-Fu的敏感性，减少5-Fu的毒副作用〖4〗。近年来，随着对细胞凋亡机制的深入研究，发现目前临床应用的大多数抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，诱导凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一〖5〗。本课题选用临床常用的化疗药5-Fu联合毒副作用较小的抗癌中药HCPT和生物药r-IFN，通过MTT法、TUNEL法及Ki-67染色法等，进行了三种各单药和联合用药对胃癌MGC-803细胞株的诱导凋亡和抗增殖作用的比较研究，为临床制定治疗胃癌的联合用药方案，提供科学的实验依据。
MTT法常用于肿瘤细胞抗肿瘤药物敏感性检测〖6〗。本实验结果表明，三种各单药和联合用药均能抑制胃癌MGC-803细胞株的生长，并表现出浓度依赖性关系，这可能是三种单药和联合用药抑制肿瘤细胞的生长和（或）诱导细胞凋亡及坏死的结果。实验中还发现，略提高各1/3单药浓度的联合用药组各单药浓度时与之对应的各单药组相比，其生长抑制率差异有显著性，说明三种单药在抑制肿瘤细胞生长中可能有协同作用。
TUNEL法为灵敏度和特异性较高的原位末端标记技术，常用于培养细胞凋亡的检测〖7〗。本实验结果显示，三种各单药和联合用药均能诱导胃癌MGC-803细胞株凋亡，这可能是药物通过凋亡相关基因诱导肿瘤细胞凋亡有关。实验中还发现，各1/3单药浓度的联合用药组与之对应的各单药组相比，其APO%差异有显著性，也说明三种单药在诱导肿瘤细胞凋亡中可能有协同作用。
肿瘤细胞的增殖细胞核抗原Ki-67的免疫细胞化学染色观察，是检测药物抑制肿瘤细胞增殖的常用方法之一，因为Ki-67抗原是全面反映细胞群体活性的良性标志物〖8〗。它存在于增殖细胞当中，在静止细胞则不表达。本实验结果表明，三种各单药和联合用药作用于胃癌MGC-803细胞株后，Ki-67的阳性表达率随药物浓度的增加和时间的延长而减少，这可能是药物的某些活性成分作用于胃癌细胞的基因调控来抑制肿瘤细胞的增殖有关。实验中也发现各1/3单药浓度的联合用药组与之对应的各单药组相比，其增殖抑制率差异有显著性，同样说明三种单药在抑制肿瘤细胞增殖中可能有协同作用。
以上实验研究结果表明，5-Fu、HCPT、r-IFN和三种药联合作用对胃癌MGC-803细胞株均有诱导凋亡和抗增殖作用；三种药联合作用组与之对应的各单药组相比，其诱导凋亡和抗增殖作用更明显，差异有显著性。本研究为恶性肿瘤的治疗新途径和胃癌的联合用药方案提供科学的实验依据。
【参考文献】
1 Joffe JK，Perren TJ，Bradleyc A，et al.PhaseⅡ stady of recom-binant in terferon-bera in combination 5-Fluorouracil in the treatment of patients with advanced carectal carcinoma. Br J Cancer，1997，75：423-426.
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6 张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性.成都：四川科学技术出版社，1995，55.
7 彭黎明，王曾礼.细胞凋亡的基础与临床.北京：人民出版社，2000，179-180.
8 郭学良，郭宗林，主余华，等.Ki-67在结肠良、恶性病变中的表达及其意义.中华消化杂志，2001，21（5）：313-314.
作者单位：133000 吉林延吉,延边大学基础医学院病理学与法医学教研部