点击显示 收起
【摘要】 目的 研究转化生长因子-β1（TGF-β1）在肺纤维化大鼠肺内表达的动态变化。方法 18只雄性Wistar大鼠被随机平均分为3组，每组6只，其中1组作为正常对照组（N组），气管内滴入生理盐水，另外2组气管内滴入博莱霉素（BLM）后形成肺纤维化模型，分别滴入博莱霉素后第7、28天处死（F1、F2组），观察肺组织病理学变化，免疫组化法和定时定量PCR法检测TGF-β1的表达。结果 肺纤维化模型组中，TGF-β1表达较正常组有明显升高（P<0.05）,而T1、T2组间表达无明显区别（P>0.05）,TGF-β1蛋白主要表达在肺泡巨噬细胞，肺泡上皮细胞及肺间质中。结论 TGF-β1升高与肺纤维化发生发展关系密切，而在肺纤维化形成过程中TGF-β1变化不明显。
【关键词】 肺纤维化 大鼠 转化生长因子-β1
The role of transforming factor-β1 in the progression of pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats
ZHU Gang,ZHOU Long-nv,ZHANG Zhi-ling.Department of Emergency,Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University,School of Medicine,Shanghai 200127,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of transforming factor-β1（TGF-β1）in this course of pulmonary fibrosis in rats.Methods Eighteen male Wistar rats were divided into three groups,one groupe as normal group（N group）.The other 2 groups were injected bleomycin to tracheae.Lungs were harvested from rats at 7、28day（F1、F2 group）.Histological staining was used to analyses the pathological changes of lung.The mRNA expression of TGF-β1 was determined by the methods of real-time PCR and immunohistochemistry.Results The expression of TGF-β1 increased in the models of pulmonary fibrosis（P<0.05）.The protein of TGF-β1 was found in alveolar macrophage,alveolar epithelium and lung mesenchyma.Conclusion The increase of TGF-β1 has an important effect on the course of pulmonary fibrosis in pathology.
【Key words】 pulmonary fibrosis;rat;TGF-β1
肺纤维化是尘肺、肉芽肿性间质性肺病以及纤维化间质性肺病的共同转归。多种细胞因子在肺纤维化过程中发挥着重要作用，促进和抑制肺纤维化相互拮抗，转化生长因子-β1（TGF-β1）在刺激细胞间基质的积聚过程中发挥尤为重要作用。笔者观察了博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化过程中TGF-β1的表达，研讨其在肺纤维化过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar大鼠清洁级，体重200～250g，购自上海必凯有限公司。
1.2 方法
1.2.1 分组 18只雄性Wistar大鼠被随机分为3组，每组6只。其中1组作为正常对照组（N组），另外2组气管内注入BLM 5mg/kg，正常组气管内滴入等量生理盐水。在气管内滴药后第7，28天每组各处死6只动物（F1、F2组）。
1.2.2 病理学检查 3组大鼠肺组织经苏木精-伊红（HE）染色切片，肺纤维化诊断标准按文献【1】的标准。按Szapiel等【2】方法评价肺泡炎及肺纤维化的程度。
1.2.3 免疫组化（SABC）方法 测定肺组织中TGF-β1蛋白质的表达。
1.2.4 TGF-β1mRNA的即时定量RT-PCR。
1.2.4.1 TGF-β1及β-actin引物序列 TGF-β1（+）5’GCT TGA ACC CAA GGA GAC CGGAATA3’（-）5’ACCTCGACGTTGGGACTGA 3’，β-actin（+） 5′CCTCTATGCAACACAGTGC 3’（-）5’ATACTCCTGCTTGCTGATCC3’。
1.2.4.2 样品的RNA抽提 按RNA提取盒操作，溶于20μl RAase-free水-70℃保存。
1.2.4.3 使用样品的RNA进行cDNA合成 加10μl的 RT反应液（RNA5μg，3.5uMoligo（dT）引物1μl加样品的RNA至10μl）到10μl退火混合物（5×RT缓冲液4μl 2.5mMdNTP混合液4μlRNA酶抑制剂1μlMMLV反转录酶1μl）中，37℃水浴60min，加热到95℃维持5min，得RT终溶液即位cDNA溶液，置冰浴待用。
1.2.4.4 实时定量PCR反应 （1）制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板：反应体系为10×PCR缓冲液2.5μl,MgCl2溶液1.5μl,20μM的PCR特异引物10.5μl,20uM的PCR特异引物20.5μl,dNTP混合液3μl，Taq聚合酶3u，cDNA 1μl加水至总体积25μl，45个PCR循环（94℃,20s；退火温度，20s；72℃,30s）；72℃延伸5min。将PCR产物进行10倍梯度稀释。（2）几个梯度稀释的DNA模板以及cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5μl，MgCl2溶液3μl，20μM的PCR特异引物0.5μl,20μM的PCR特异引物0.5μl,dNTP混合液3μl，Taq聚合酶3u，Sybergreen终浓度0.25×，cDNAorDNA 1μl加水至总体积25μl，TGF-β194℃5min;40个PCR循环【94℃,20s;56℃,20s;72℃,20s;83.5℃（收集荧光），10s】；β-actin94℃5min；40个PCR循环【94℃，20s；58℃，20s；72℃，20s；85℃（收集荧光），10s】。（3）结果和计算根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,各样品浓度结果直接由机器生成,每个样品的基因浓度除以β-actin的浓度,即为该样品基因校正后的相对含量。
1.3 统计学处理 运用STATPAL统计软件进行t检验，数据以x±s表示。
2 结果
2.1 苏木精-伊红（HE）染色切片结果观察 正常对照组（N组）大鼠无明显病变，实验组大鼠灌注BLM后第7天（F1组）肺泡炎变化明显，肺泡腔内可见大量炎性细胞渗出，肺间质内毛细血管增生，第28天（F2组）肺泡炎程度减轻，肺泡结构破坏，肺泡萎陷，肺间质出现大量胶原纤维和成纤维细胞。
2.2 免疫组化（SABC）方法测定肺组织右TGF-β1蛋白质的表达 正常对照组大鼠TGF-β1表达不明显，在实验组大鼠灌注BLM后，TGF-β1表达在支气管黏膜上皮，支气管腺体及肺泡巨噬细胞中。
2.3 TGF-β1mRNA表达 实验组大鼠灌注BLM后，第7天（F1组）及第28天（F2组）TGF-β1mRNA表达明显高于正常对照组（N组）大鼠TGF-β1mRNA表达（P<0.05）,F1组与F2组间无明显区别（P>0.05）。见表1。表1 TGF-β1mRNA半定量值比较 注：F1、F2组相比N组均有显著升高（*P<0.05）;F1组与F2组组间无差别（**P>0.05）
3 讨论
肺纤维化是一组由多种病因引起的肺破坏性疾病，其发病机制尚未阐明，但一般认为早期为肺炎症及肺损伤，晚期为细胞外基质（胶原纤维）的沉积。近年来，对于肺内多种细胞因子的研究使得肺纤维化机制的研究取得了重要的进展。在参与肺纤维化的细胞因子中，TGF-β是研究最深入、最重要的细胞因子。
本实验表明TGF-β1在肺纤维化过程中明显上升，与肺纤维化显著相关，提示TGF-β1在肺纤维化过程中有着显著促进作用，TGF-β1由血小板、巨噬细胞、内皮细胞等产生，它能促进成纤维细胞趋化，产生胶原和纤维连接蛋白，抑制胶原降解，在组织器官的纤维化中发挥了十分重要的作用，被公认为纤维化形成与发展的启动枢纽，是关键性细胞因子。TGF-β的生物学功能:（１）趋化并促进成纤维细胞分裂增殖及成熟分化;（2）刺激成纤维细胞大量合成胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，尤其是Ⅳ型胶原蛋白，以增加肺间质的胶原成分，同时又抑制胶原蛋白本科及纤溶酶原激活物的合成，增加蛋白酶抑制物的形成，以减少肺间质ECM的降解，造成ECM调节失控;（3）抗炎作用TGF-β1可通过调节免疫系统来抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞，同时通过NO产生对巨噬细胞的细胞毒性;（4）抑制细胞外基质自身的稳定。
在肺纤维化的预防与治疗中，临床可能通过对TGF-β1的干预发挥积极作用。
【参考文献】
1 万秋红.TGF-β超家族信号传导机制研究进展.国外医学·分子生物学分册，2000，22（3）：137.
2 Broekelmann T,Limper AH,Colby TV,et al.Transforming growth factor beta 1 is present at sites of extracellular matrix gene expression in human pulmonary fibrosis.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88（15）:6642-6646.
3 Khalil N,Bereznay O,Sporn M,et al.Macrophage production of transforming growth factor beta and collagen synthesis in chronic pulmonary inflammation.J Exp Med,1989,170（3）:727-737.
4 Zhang K,Flanders KC,Phan SH.Cellular localization of transforming growth factor-betaexpression in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.Am J Pathol,1995,147（2）:352-361.
5 Awad Mr,El-Gamel A,Hasleton P,et al.Genotypic variation in the transforming growth factor-beta 1 gene:association with transforming growth factor-beta 1 production,fibroticlung disease,and graft fibrosis after lung transplantation.Transplantation,1998,66（8）:1014-1020.
6 Breen E,Shull S,Burne S,et al.Bleomycin regulation of transforming growth factor-betamRNA in rat lung fibroblasts.Am J Respir Cell Mol Biol,1992,6（2）:146-152.
7 Utsugi M,Dobashi K,Ishizuka T,et al.C-Jun-NH2-Terminal Kinase Mediates Expression of Connective Tissue Growth Factor Induced by Transforming Growth Factor-beta 1 in human lung fibroblasts.Am J Respir Cell Mol Biol,2003,28:754-761.
8 马跃文，佟振月，侯显明.TGF-β1在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织不同细胞表达的定量研究.中国医科大学学报，1998，27（5）：467-471.
9 刘纯洁，王德文，郑兆荣.转化生长因子β与器官纤维化.军事医学科学院院刊，1997，21（4）：285.
10 Hironobu Ihn,MD Ph D.Pathogenesis of fibrosis:role of TGF-β and CTGF.Current Opinion in Rheumatology,2002,14:681-686.
作者单位：200127 上海，上海交大医学院附属九院急诊科