胶质瘤患者树突状细胞在裸鼠体内外诱导抗肿瘤免疫

【摘要】  探讨胶质瘤患者树突状细胞（Dendritic cells,DCs）在裸鼠体内外能否诱导抗肿瘤免疫。 方法 用细胞因子从胶质瘤患者外周血诱导DCs，MTT法检测DCs激活的细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）在体外对肿瘤细胞的作用。将裸鼠接种DCs，1周后用胶质瘤细胞攻击，观察成瘤潜伏期、成瘤率、瘤重量及瘤体积。结果 用细胞因子能从患者外周血诱导大量DCs，该DCs激活的CTLs在体外对胶质瘤细胞产生了高效而特异的抑制及杀伤作用。在裸鼠体内，DCs有免疫保护作用，其成瘤率减低，潜伏期延长，瘤重及瘤体积均显著降低。 结论 胶质瘤患者DCs能在裸鼠体内外诱导高效的抗肿瘤免疫。

【关键词】  胶质瘤 树突状细胞 裸鼠

    Antitumor immunity of dendritic cells obtained from patients with glioma in vivo and nude mice

    WANG Xiu-jin.Department of Neurology, Central Hospital of Jinzhou City, Liaoning 121000, China

    【Abstract】  Objective  To investigate whether dendritic cells (DCs） obtained from patients with glioma can induce antitumor response in vivo and nude mice. Methods  DCs were induced by cytokines from the peripheral blood of patients. The antitumor effect of cytotoxic T lymphocytes (CTLs）, stimulated by DCs, was observed in vivo. Then the nude mice were injected with DCs one week before they were attacked by glioma cells.Results  DCs could be induced from the peripheral blood of patients and the CTLs, actived by DCs, could induce effective antitumor response in vivo. In Addition, DCs could protect the nude mice and the weight or volume of tumor cut down significantly. Conclusions  DCs obtained from patients with glioma can induce effective immune response on tumor in vivo and nude mice.

    【Key words】  glioma; dendritic cells; nude mouse

    胶质瘤是颅内常见的肿瘤之一，其发病率及死亡率逐年上升。近年来的研究表明，树突状细胞（Dendritic cells,DCs）在启动、调节并维持肿瘤免疫反应中发挥重要作用【1～3】。本实验通过观察胶质瘤患者DCs体内外抗肿瘤作用，意欲探索胶质瘤免疫治疗新途径。

    1  材料与方法

    1.1  材料  细胞因子（IL-4、GM-CSF）购自Glaco公司；CD86、CD1a、HLA-DR、CD54、CD83McAb购自DAKO公司；外周血来自辽宁省锦州市中心医院临床确诊病人；胶质瘤细胞株SK-MG-1购自北京医科大学；SGC-7901人胃癌细胞株、BeL-7402人肝癌细胞株购自中山大学。4周龄BALB/C裸鼠购自北京医科大学。

    1.2  方法

    1.2.1  制备冻融抗原  取107个SK-MG-1胶质瘤细胞，加入1ml生理盐水，反复冻融3次后稀释到10ml，微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

    1.2.2  制备T细胞及DCs  取患者外周血，Ficoll 不连续密度梯度离心法分离单个核细胞，孵育2h后收集非贴壁细胞作为T细胞备用，贴壁单核细胞用含GM-CSF（1000u/ml）、IL-4（1000u/ml）、15%FCS的完全培养基培养。3天将细胞分为2组：负载组（加入冻融抗原）、未负载组（加入培养基）。7天收集悬浮细胞即为DCs。用CD86、CD1a、HLA-DR、CD54、CD83McAb标记，流式细胞术检测DCs表面分子。

    1.2.3  DCs激活T细胞  将T细胞制成1×106细胞/ml悬液，加入24孔培养板(1ml/孔）。DCs经丝裂霉素处理后按1：20加入到培养体系中。72 h后收集细胞即为细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）。

    1.2.4  CTLs杀伤活性试验  于96孔板中分别加入SK-MG-1、BeL-7402、SGC-7901细胞作为靶细胞（5000细胞/孔），按10：1分别加入负载组DCs活化的CTLs、未负载组DCs活化的CTLs、未受DCs活化的单纯T细胞，以加入培养基作阴性对照。37℃、5%CO2培养72h，加入MTT继续培养4h，检测OD值。

    1.2.5  裸鼠体内实验  18只裸鼠随机分3组,分别接种负载及未负载抗原DCs(2×105个细胞/鼠），生理盐水为对照组。隔日1次，共3次,1周后注射SK-MG-1胶质瘤细胞（2×106个细胞/鼠）。观察成瘤率、潜伏期。接种癌细胞后30天测瘤重、瘤体积（V= 肿瘤最长径×最短径2/2）。

    1.2.6  统计学方法  所有数据用x±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。 

    2  结果

    2.1  用细胞因子可以从胶质瘤患者外周血获得大量DCs。流式细胞术分析显示：负载与未负载抗原组DCs均高表达CD86、CD1a、HLA-DR、CD54、CD83等表面分子。

    2.2  DCs对T细胞杀伤靶细胞的影响  负载组DCs诱导的CTLs可特异性抑制和杀伤SK-MG-1胶质瘤细胞，与其他组相比，差异具有显著性（P＜0.01）,结果见表1。表1  DCs对T细胞杀伤靶细胞的影响 注：使用单因素方差分析，*P＜0.01

    2.3  裸鼠体内实验  对照组、未负载抗原DCs组小鼠均在肿瘤细胞攻击后1周成瘤（7±1天），成瘤率100%；负载抗原DCs组６只小鼠中有５只在第2周（14±2天）成瘤，成瘤率84%。肿瘤体积及重量见表2。 表2  裸鼠体内实验肿瘤的重量及体积注：使用单因素方差分析，*P＜0.01，**P<0.01

    3  讨论

    肿瘤患者DCs的数量较少，而且往往存在免疫功能缺陷，无法激发特异性抗肿瘤免疫反应。因此，如何扩增及增强肿瘤患者DCs免疫功能是肿瘤免疫治疗的关键【4】。研究表明，应用细胞因子能促进人外周血DCs优势增殖，并增强其免疫功能。因此，本实验采用细胞因子从胶质瘤患者外周血单个核细胞诱导扩增DCs，结果该DCs经抗原负载后能在体外将抗原有效提呈给T淋巴细胞，使其形成具有杀伤活性的CTLs，从而诱导出对SK-MG-1胶质瘤细胞的高效而特异的杀伤及抑制作用。此外，笔者在裸鼠体内实验中发现，接种负载抗原DCs后的裸鼠能抵抗癌细胞的攻击,其潜伏期长、成瘤率低、瘤体积及重量均较其他组小，表明负载抗原的DCs在裸鼠体内能有效诱导针对SK-MG-1胶质瘤细胞的抑制及杀伤作用，使机体对肿瘤细胞的攻击以及肿瘤的生长产生有效的免疫保护及免疫抑制作用。

    给予全细胞抗原负载DCs是一种简便而有效的方法,不需要鉴定抗原,而且多个肿瘤抗原的存在可以减少抗原阴性逃避突变带来的危险【5,6】。因此，笔者采用肿瘤细胞冻融抗原直接作为肿瘤抗原负载DCs,由DCs去选取肿瘤抗原并对其加工、呈递,有效地激活Ｔ细胞，从而诱导肿瘤特异性免疫反应。该方法简便有效,便于临床应用。

    本实验应用细胞因子从胶质瘤患者外周血诱导扩增大量DCs，负载肿瘤抗原后能在裸鼠体内外抑制胶质瘤细胞生长并增强机体的抗瘤能力，既解决了胶质瘤患者体内DCs数量甚微的问题，又增强了DCs的免疫功能。那么如果将这些DCs回输患者体内则无疑将为恢复并增强肿瘤患者抗瘤免疫力提供有效途径。

【参考文献】
  1 Dililglou S,Cruse JM,Lewis RE.Costimulatory function of umbilical cord blood CD14+ and CD34+ derived dendritic cells.Exp Mol Pathol,2003,75(1）:18-33.

2 苏敏,钟翠平.树突状细胞对外源性抗原的摄取和加工机制.解剖科学进展, 2003,9 (3）:242-245.

3 杜英,陈绍清,黄玉敏,等.树突状细胞及exosomes体外诱导抗胶质瘤细胞毒活性的研究.免疫学杂志, 2006,22(6）:664-667.

4 康宁,李冬田.树突状细胞与肿瘤的免疫治疗.天津医药,2000,28(9）:574-576.

5 古涛,朱一蓓,李敏，等.肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究.中国病理生理杂志,2003,19(3）:301-305.

6 Bachleitner-Hofmann T,Stift A,Fridel J,et al.Stimulation of autologous antitumor T-cell responses against medullary thyroid carcinoma using tumor lysate-pulsed dendritic cells.J Clin Endocrinol Metab, 2002,87(3）:1098-1104.

作者单位：121000 辽宁锦州,锦州市中心医院神经内科