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【摘要】 目的 探讨CD44V-mRNA在监测直肠癌术后复发、转移中的临床意义。方法 应用荧光定量PCR技术（real-timePCR）检测60例直肠癌根治术后复查患者外周血CD44V-mRNA水平，并与血CEA、临床及影像学检查结果比较。结果 60例患者中23例外周血CD44V-mRNA检测阳性。在23例检出阳性者中，8例证实为局部复发转移；9例证实为远处转移（8例肝转移，1例肺转移）。故其预测肿瘤进展阳性预测值为74%（17/23）。在37例外周血CD44V-mRNA检测阴性患者中，共有4例局部复发转移；1例远处转移（肺）。故其阴性预测值为86.5%（32/37）。总计22例肿瘤进展患者中17例外周血CD44V-mRNA阳性，其中局部复发12例；8例外周血CD44V-mRNA阳性。远处转移10例患者中，9例外周血CD44V-mRNA阳性。38例临床缓解患者中6例外周血CD44V-mRNA阳性。故其敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率和阴性率分别为77.3%（17/22）、84.2%（32/38）、15.8%（6/38）、22.7%（5/22）、81.6%（49/60）。局部复发患者、远处转移患者、肿瘤进展患者和临床缓解患者CD44V-mRNA阳性率和中位拷贝数分别为66.7%（8/12）4200copies/ml、90%（9/10）155000 copies/ml、77.3%（17/22）6500copies/ml、15.8%（6/38）<500copies/ml。远处转移患者与局部复发患者比较、肿瘤进展患者与临床缓解患者比较，外周血CD44V-mRNA阳性率和中位拷贝数差异均有显著性。结论 外周血CD44V-mRNA水平的检测是监测直肠癌患者转移、复发的有效指标。
【关键词】 直肠癌；CD44V-mRNA；荧光定量PCR；外周血
Clinical significance of quantitative analysis of CD44VmRNA in peripheral blood of rectum cancer after radical surgery
DING Jian-wu, LUO Jun-ming, SHEN Wei, et al.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006，China
【Abstract】 Objective To evaluate the clinical significance of quantitative analysis CD44vmRNA in peripheral blood of rectum cancer after radical surgery.Methods 60 rectum cancer patients after radical surgery were included in this study. Blood samples were taken and peripheral blood CD44vmRNA was analyzed using Real-Time PCR technique. The results were compared with clinical work ups. Results Peripheral blood CD44vmRNA was detectable in 23 of 60 patients. Among 23 cases of CD44vmRNA detectable cases, 8 had recurrent diseases and 9 had metastatic diseases. Thus the positive predictive value was 74% for disease progression. Among 37 of CD44vmRNA undetectable cases, there were 4 cases of recurrent diseases and 1 case of metastatic disease. So the negative predictive value was 86.5%. Altogether, there were 12 cases of recurrence, 10 cases of metastases and 38 disease-free cases. Peripheral blood CD44vmRNA was detectable in 8 of 12 cases with recurrence, 9 of 10 cases with metastases and 6 of 38 disease-free cases. The sensitive, specific, false positive, false negative and accurate rates were 77.3% （17/22）, 84.2% （32/38）, 15.8% （6/38）, 22.7% （5/22） and 81.6% （49/60） respectively. The positive ratios and median concentrations of CD44vmRNA were 66.7%, 4200 copies/ml; 90%, 155000 copies/ml; 77.3%, 6500 copies/ml; and 15.8%,＜500 copies/ml respectively for recurrent, metastatic, progression and disease-free groups.Conclusion Peripheral blood CD44vmRNA analysis is useful for surveillance of rectum cancer after radical surgery.
【Key words】 rectum cancer; CD44vmRNA; fluorescence quantitative PCR; peripheral blood
直肠癌是常见恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。影响直肠癌的生存期因素主要为术后的复发和转移，因此对肿瘤微转移的检测判断尤为重要。随着分子生物学技术的发展，特别是逆转录多聚酶链反应技术（real-timePCR）的成熟和完善，准确检测外周血、腹腔内微转移肿瘤细胞成为可能。细胞粘附分子CD44是一个具有潜在价值的肿瘤转移标记物，特别是CD44变异体（CD44V）与很多恶性肿瘤微转移有明显相关性【1】。笔者利用RT-PCR技术对直肠癌根治术后复查患者外周血中CD44V-mRNA进行检测，研究CD44V-mRNA在直肠癌微转移中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2004年7月～2006年12月本院60例直肠癌根治术后复查患者，男46例，女14例；年龄27～72岁，中位年龄54岁。所有病例均为根治术后6个月～5年时间不等复查患者，均经术后病理诊断为直肠腺癌，其中中分化腺癌43例，低分化腺癌17例。
1.2 临床检查方法 临床检查内容包括：盆腔CT增强扫描、腹部B超、胸片。胸片或腹部B超有可疑转移则行胸部或腹部CT扫描。如患者有骨痛症状则行全身核素扫描检查。
1.3 CD44V-mRNA测定
1.3.1 取材及处理 用0.5ml肝素预处理的5ml无菌注射器抽取直肠癌复查患者外周5ml，用淋巴细胞分离液（LSM）法取有核细胞层，在5ml的新鲜抗凝血中加入2ml的淋巴细胞分离液，2000r/min 5min，有核细胞在LSM上部，首先吸出上层血浆和血小板，用另一吸管小心吸出有核细胞层，用PBS缓冲液稀释有核细胞至5ml，以1500r/min离心10min，PBS缓冲液稀释重复一次，取有核细胞层置于1.5ml Eppendorf管，保存于低温冰箱。
1.3.2 荧光定量PCR 用液氮将冻存的血液标本磨成粉末，趁液氮挥发时，把粉末转移至EP管中，每50mg组织中加入0.5ml的Trizol，用枪头反复抽吸混匀；用1ml针筒、26号针头抽吸匀浆以剪切基因组DNA两次，然后用同一根针筒将样品转移到无菌1.5ml EP管中；加入100μl氯仿异丙醇混合液（24：1），剧烈振荡混匀30s；用台式离心机，12000r/min，室温离心5min；将上清液（约450μl）小心转移到无菌Rnase-free1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，混匀。RNA提取液和CD44V-mRNA扩增荧光检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。操作方法按试剂盒说明进行。逆转录：应用AMV reverse transcriptase 试剂盒反转录RNA为cDNA，循环参数为25℃10min，48℃30min，95℃5min。检测cDNA的质量：应用265bp的B-actin做内参照，上游引物序列5’-AGGCCGGCTTCGCGGGCGAC-3’，下游引物序列5’-CTCGGGAGCCACACGCAGCT-3’，循环参数为：94℃60s和72℃90s，设置35个循环，应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度，如出现阳性结果视为cDNA合格。PCR扩增：用检测合格的cDNA行PCR扩增片段长度为196bp位于CD44cDNA序列的第396～421位及第568～593位碱基对之间，在1个0.2ml EP管中加入CD44VcDNA8μl，加入10*Buffer，2.5mMMgc12，dNTPs（10mM），CD44V正反义引物，TaqDNA聚合酶，总反应体系为50μl，离心混匀后，放入PCR仪扩增，反应条件：94℃10min预变性，扩增参数为：94℃变性6s，56℃退火60s，72℃延伸90s，扩增40个循环，72℃延伸7min。采用海枫林FTC-2000实时荧光定量PCR仪进行检测，检测步骤、结果判断以及质量控制按厂家说明。检测极限为5×102copies/ml,大于或等于该值为阳性。
1.4 统计学处理 实验所得数据均采用SPSS10.0软件进行统计学处理。血CD44V-mRNA检出率的比较采用χ2检验, 血CD44V-mRNA拷贝数的比较用Mann-Whitney U非参数秩和检验。
2 结果
2.1 外周血CD44V-mRNA水平测定结果 60例复查患者中，23例检测阳性，37例检测为阴性。在23例检测阳性患者中，8例同时经临床影像学和病理检查证实为局部复发，9例证实为远处转移（8例肝转移，1例肺转移）。另外，6例阳性患者经1年随诊未发现复发转移，其预测肿瘤进展阳性预测值为74%（17/23）。在37例检测阴性患者中，4例临床诊断为局部复发转移，1例为远处转移（肺），故其阴性预测值为86.5%（32/37）。60例复查患者中38例经临床检查后处临床缓解期，22例诊断为肿瘤进展。在38例临床缓解患者中，6例CD44V-mRNA阳性，故假阳性率为15.8%（6/38），22例肿瘤复发或转移者中，5例CD44V-mRNA检测阴性，故假阴性率为22.7%（5/22）。在22例临床确诊复发转移患者中，有17例外周血CD44V-mRNA阳性，故诊断敏感性为77.3%（17/22）。在38例临床缓解患者中，共有32例外周血CD44V-mRNA检测阴性，故其诊断特异性为84.2%（32/38）。49例患者外周血CD44V-mRNA水平与临床结果相符，故准确性为81.6%（49/60）。CD44V-mRNA检测结果与肿瘤控制状态的关系见表1。表1 CD44V-mRNA检测结果与肿瘤控制状态的关系
2.2 不同肿瘤控制状态外周血CD44V-mRNA阳性率及中位拷贝数比较 60例复查患者中，共有22例（37.6%）确诊为肿瘤进展，其中肿瘤局部复发转移12例，远处转移10例。12例局部复发者中，8例（66.7%）CD44V-mRNA阳性，拷贝数为检测极限～2.23×105copies/ml，中位拷贝数为4200copies/ml。10例远处转移患者中，9例（90%）CD44V-mRNA阳性，拷贝数为检测极限～7.62×105copies/ml，中位拷贝数为155000copies/ml。在22例肿瘤进展患者中，17例（77.3%）CD44V-mRNA阳性，拷贝数为检测极限～3.54×105copies/ml，中位拷贝数为6500copies/ml。38例临床缓解患者中，6例（15.8%）外周血CD44V-mRNA阳性，拷贝数为检测极限～2.70×104copies/ml，中位拷贝数≤检测极限。局部复发患者与远处转移患者比较，肿瘤进展患者与临床缓解患者比较，阳性率和拷贝数差异均有显著性（检出率的比较采用卡方检验，外周血CD44V-mRNA拷贝数的比较Mann-Whitney U非参数秩和检验，P值<0.05）。各组外周血CD44V-mRNA检出率及中位拷贝数比较见表2。表2 不同肿瘤控制状态外周血CD44V-mRNA中位拷贝数及检出率比较
3 讨论
局部或区域复发和远处转移是直肠癌治疗失败的重要原因，即使手术治疗后完全缓解者，仍有40%～70%因局部复发和远处转移而导致治疗失败。依靠常规的临床检查手段来诊断肿瘤复发或转移。在诊断时多数复发病灶较大或出现多处转移，治疗效果较差，因此提前准确判断直肠癌患者外周血中是否已有肿瘤细胞微转移，对于肿瘤的综合治疗，准确判断预后，预防复发有着很重要的意义。随着1991年Smith等首次应用PCR技术检测到血液循环中存在转移的癌细胞之后，PCR、RT-PCR技术被广泛应用于微转移研究。检测大肠癌微转移已成为近年研究的热点之一。细胞粘附分子CD44是在多种细胞内广泛分布的跨膜糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均能检测到它的表达；作为一种粘附分子，主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连过程。CD44基因位于11P13，CD44标准型为CD44s，CD44变异体为CD44V。1992年Matsumura在CD44V区外显子插入位点，两侧设计引物，对癌标本中CD44V基因所表达的mRNA进行逆转录PCR扩增，并分别用插入位点的旁侧寡核苷酸探针和V6外显子的寡核苷酸探针对PCR产物做Sourthern印迹杂变，结果发现正常组织和结肠癌组织标本都能检测到CD44s表达，但CD44V表达两者截然不同，所有来源于肿瘤转移患者的原发和继发肿瘤组织标本均能检测到，而正常组织细胞只是偶尔检测到低水平表达。免疫组化也证实人正常结肠黏膜上皮细胞只以低水平表达CD44s蛋白，而CD44V几乎没有表达。在癌组织中CD44V阳性细胞数量达到30%～99%。CD44与大肠癌微转移有密切关系【2】。自Gunthert等【3】发现通过转染CD44V于表达CD44s的小鼠胰腺腺癌细胞使此细胞获得了转移潜力以来，CD44V促进肿瘤侵袭转移得到越来越多的实验支持。Yamaguchi等【4】研究发现进展性胃癌患者CD44V6的表达与血性转移和长期缓解有明显关系。孙焰等【5】研究发现CD44V6在肺癌淋巴结转移病例中高达91%。他们认为CD44V6与非小细胞肺癌的淋巴结转移有关，具有一定的临床辅助诊断价值。卢佩琳等【6】对人大肠腺癌和增生性腺瘤CD44v表达进行检测发现，正常结肠黏膜阳性表达率为10%，轻度非典型增生性腺瘤升高到67%，伴有灶性癌的腺瘤癌样变高达97%。王道荣等【7】通过研究发现胃癌患者外周血清中sCD44v含量及组织中CD44v6且b表达的变化与转移、临床分期、病理分期有关，sCD44v含量升高可作为胃癌患者淋巴结转移（尤其是早期转移）的监测指标。岳树强等【8】通过CD44mRNA在伴有静脉侵袭的结直肠癌中的表达及其与肝转移的关系的研究发现CD44mRNA在伴有静脉侵袭、肝转移患者中明显呈高表达，提示对判断癌细胞的肝转移具有一定的参考价值。笔者的研究表明，血浆CD44mRNA的检测对直肠癌术后的复发和转移均有较大的临床意义。同时，远处转移患者血浆中CD44mRNA阳性率和拷贝数均显著高于局部/区域复发者。因此，CD44mRNA检测在早期诊断直肠癌远处转移的意义大于诊断局部复发的意义。另外，笔者发现，CD44mRNA检测直肠癌术后肿瘤进展的敏感性为77.3%，特异性为84.2%。说明单纯采用该方法漏诊率较高但误诊率较低，应与其他检查方法（如血CEA、CA199和CT、MRI等）结合综合判断有助于降低漏诊率。总之，笔者认为，检测直肠癌术后患者血浆CD44mRNA是监测肿瘤进展的有效方法，但通过该方法诊断早期复发和转移并采取临床干预措施是否能提高患者生存率等仍要进一步研究。随着分子生物学不断的发展，癌基因研究的不断深入，相信该基因对癌的预测、诊断治疗、预后的价值会得到更加全面的认识。
【参考文献】
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8 岳树强,窦科峰.增殖细胞核抗原和CD44mRNA在伴有静脉侵袭的结直肠癌中的表达及其与肝转移的关系.第四军医大学学报，2002,23（16）：1511-1513.
作者单位：330006 江西南昌，南昌大学第二附属医院