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【摘要】 背景 在20世纪90年代初期，我国用单采血浆法采集血浆量迅速增加。与此同时，大量单采血浆献血者也发生了丙型肝炎病毒感染。为了解这些感染者的健康状况和预后，本研究组选择了一些感染的献血浆者进行长期追踪观察。目的 对发生丙型肝炎病毒(HCV)感染的献血者进行为期15年的多项指标的动态变化观察，评估疾病进程和预后。方法 选择某县于1993年10月HCV抗体由阴性转为阳性的献血者，每年定期抽取血液标本进行HCV-RNA、HCV抗体、ALT和凝血酶原时间测定等，同时进行体格检查、肝脏B超检查等。 其中9名志愿者在追踪15年后做了肝组织活检。结果 27名观察对象(即受试者)在15年中抽取血液标本19次，共400余份标本, 肝活检标本9份(2009年4月)。按照15年观测期间中HCV-RNA和抗-HCV阳性检出率, 血清ALT异常率,及这些指标的动态变化趋势, 27名HCV感染者可分为轻重两组。第1组8名，血清(血浆)HCV-RNA在近3年(2006年—2009年)的检测中低于最低检出限 (< 1000cops/ml); 在连续15年的阳性率检出率为42.6%(58/136);血清ALT异常率为11.1%(16/144);肝组织病理检查3例，分级(G)分期(S)为G1S0 1例，G1S1 2例。第2组19名，血清(血浆)HCV-RNA在连续15年中多为持续阳性，阳性率为88.5%(293/331);血清ALT异常率49.1%(171/348);肝组织病理检查6例，分级分期为G2S1 3例，G1S0 1例，G2S0 1例，G1S1 1例。根据肝组织病理检查结果,9名志愿者均诊断为轻度慢性肝炎。结论 被追踪观察15年的27名HCV感染的献血者病情进展有差异，第1组8名HCV感染者估计处于疾病恢复阶段或平稳阶段;第2组19名HCV感染者疾病可能有发展趋势。HCV感染的病情进展程度可能与感染的HCV 基因型相关。建议对病情明显进展者进行适当治疗。
【关键词】 丙型肝炎病毒(HCV);感染;HCV-RNA;抗-HCV;ALT;献血者
Dynamic changes of multi-marker in HCV-infected blood donors: follow-up observation on 27 subjects for 15 years
JI Yang, YUAN Yu-zhe, WANG Xue-chun, et al. Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Chengdu 610081，China
【Abstract】 Background In the early part of 1990s, the amount of plasma collected by plasmapheresis had been increased rapidly in China. At the same time, many plasma donors were infected with HCV. In order to understand their status of health and disease course, some HCV-infected plasma donors were selected as subjects for following-up observation. Objective To track the dynamic changes of HCV- infected multi-marker and prognosis in blood donors during 15 years' HCV infection.Methods Blood specimens from 27 HCV-infected subjects were collected periodically, and multi-markers including serum (plasma) HCV-RNA, anti-HCV, ALT and thrombinogen time were detected. Liver biopsies were performed on 9 volunteered donors after 15 years' infection. General physical examination and B-ultrasounds on liver and spleen were also performed on all subjects.Results In 15 years, more than 400 serial serum samples and 9 liver biopsy samples (on April, 2009) were collected. According to HCV RNA and anti-HCV positive rate, ALT abnormal rate, as well as the dynamic change tenden- cy, 27 subjects were divided into two groups: 8 subjects (the first group) tend to resolve their HCV-infections, in which HCV RNA were lower than the detection limit (< 1000cops/ml) in the most recent detections (2006 and 2009); The HCV RNA positive rate and the ALT abnormal rate in 15 years was 42.6% (58/136) and 11.1% (16/144) respectively. The liver biopsies of 3 subjects showed 1 case was G1S0, and 2 Cases were G1S1 according to the national standard.19 subjects (the second group) remain chronically infected and were clearly HCV RNA positive in the most recent detections. HCV RNA positive rate and the ALT abnormal rate during 15-year infection is 88.5% (293/331) and 49.1% (171/348) respectively. The liver biopsies in 6 subjects showed 3 cases were G2S1, and 3 cases were G1S0, G1S1 and G2S0. All 27 subjects were generally in good health condition in the passed 15 years. According to the liver biopsy result, all 9 volunteer donors were diagnosed as mild chronic hepatitis. Some of subjects were detected to be hepatolienomegaly by B-ultrasound detection and physical examination.Conclusion 27 HCV-infected subjects have different disease progression rate during 15-year HCV infection. 8 subjects in the first group were in HCV-infected convalesce stage, and 19 subjects in the second group might be in progress stage. The different progress rate after HCV infection might be correlated to different HCV subtype. It is suggested to treat 19 disease progressing subjects.
【Key words】 HCV; infection; HCV-RNA; anti-HCV; ALT; blood donor
丙型肝炎病毒(HCV)感染后易发生慢性化，超过80%的HCV感染者发展为慢性HCV携带者或慢性肝炎[1,2]。在20世纪90年代初，由于不规范采血致使我国不少地区单采血浆献血者发生大范围的丙型肝炎病毒感染传播[2]。关于这些感染者未来的健康状况、疾病进程及预后如何，是人们十分关心的问题。本研究组在美国CMB基金支持下，于1993年10月选择了30名血清HCV抗体刚由阴性转为阳性的单采血浆献血者(供血浆者)，进行了长期多项指标的动态变化观察，并进行了肝组织检查和体格检查，至今已愈15年，部分资料已作报道[3～6]。现将具有较完整的前瞻性追踪观察资料的27名HCV感染的献血者追踪观察结果报道于下。
1 材料与方法
1.1 观察对象(受试者)选择四川省某县于1993年10月HCV抗体(抗-HCV)由阴转阳的单采血浆献血者(供血浆者)，定期抽取血样检测。1993年10月—2009年4月的15年6个月，共抽血样19次，计400余份标本。
1.2 检查项目与方法 (1)血清(血浆)HCV-RNA：用套式PCR试剂，或荧光定量PCR试剂检测，病毒定量1×103cops/ml以上判HCV-RNA阳性。(2)抗-HCV ELISA法：用上海科华公司试剂检测，被选择的观察对象首次检测均为ELISA抗-HCV阳性。抗-HCV RIBA法：用美国Chiron公司重组免疫印迹试剂(RIBA)。1997年前用Chiron公司第2代RIBA试剂(RIBA-2)，1998年后用第3代RIBA试剂(RIBA-3)(包括Chiron公司与新加坡Genelabs公司试剂)。判定结果按试剂盒说明书要求。(3)血清ALT：用四川迈克公司赖氏法试剂。血清ALT正常参考值为≤25U。
2 结果
2.1 27名感染者15年中HCV-RNA、抗-HCV和ALT检测结果 通过15年系列血样HCV-RNA检测结果分析，将27名观察对象分为两组。第1组8人，血清(或血浆)HCV-RNA阳性率较低;第2组19人，HCV-RNA阳性率较高。详见表1和表2。 表1 第1组8名HCV感染的献血者15年中4项指标的阳性率表2 第2组19名HCV感染的献血者15年中4项指标的阳性率根据表1和表2结果，对两组观察对象的系列标本的HCV-RNA、HCV抗体和ALT检测结果进行了对比。详见表3。 表3 两组HCV感染者15年中3项指标检测结果对比注：第1组同第2组比较，第1组的HCV-RNA和HCV抗体阳性率均低于第2组，第1组的ALT升高率明显低于第2组
2.2 血清(血浆)HCV-RNA 15年中波动情况 从血清(血浆)HCV-RNA 波动情况，可以看出，第1组8名受试者血清(血浆)HCV-RNA经常呈间隙性阴阳交替(见表4);第2组19名受试者血清(血浆)HCV-RNA多为持续性阳性,偶有阴阳交替(见表5)。两组HCV-RNA阳性率有明显差异(42.6% : 88.5%，P<0.005)。表4 第1组8名HCV感染者HCV-RNA检测结果波动情况表5 第2组19名HCV感染者HCV-RNA检测结果波动情况注： HCV-RNA阳性率为88.5%(293/331);表中空格为缺标本未检测
2.3 两组系列标本用ELISA试剂检测HCV抗体的波动情况 见表6、表7。 表6 第1组 8名HCV感染者15年中ELISA法抗-HCV检测结果注：第1组 8人 ELISA法检测抗-HCV阳性率为89.7%(122/136)。S/CO为标本OD值与临界值之比表7 第2组 19名HCV感染者15年ELISA法抗-HCV检测结果注：第2组 19人 ELISA法检测抗-HCV阳性率为99.1%(326/329)
表6和表7的数据表明，用ELISA法检测感染者系列标本HCV抗体，结果两组感染者均表现持续抗-HCV阳性。但最后一次检测显示第1组感染者抗-HCV有明显减弱趋势(4/7转阴性)。
2.4 两组HCV感染的献血者系列标本用RIBA试剂检测血清HCV抗体的波动情况 见表8、表9。表8 第1组8名HCV感染者15年中RIBA法抗-HCV检测结果表9 第2组19名HCV感染者15年中RIBA法抗-HCV检测结果注：第2组RIBA法检测抗-HCV阳性率为99.4%(309/311) 从表8和表9的结果可以看出，第1组8人血清标本用RIBA法检测时，出现较多HCV抗体不确定结果。两组比较，第1组HCV抗体明显减弱。抗-HCV阳性率第2组明显高于第1组。
2.5 两组HCV感染者系列血液标本ALT的动态变化 见表10、表11。表10 第1组8名感染者ALT的动态变化注：第1组8人ALT异常率(正常≤25u)11.1%(16/144)表11 第2组19名感染者ALT动态变化 注：第2组19人ALT异常率(正常≤25U)49.1%(171/348)
从表10和表11结果对比，可以看出第1组ALT异常率(11.1%)远低于第2组(49.1%)。 2.6 HCV感染的献血者15年血样凝血酶原时间测定结果 见表12。 表12 HCV感染15年后献血者血液凝血酶原时间测定结果表12显示24人血液标本凝血酶原时间检测结果中，23人均在正常值范围(16秒以内)，1人(NO.8)略升高(16.6秒)。
2.7 近3年来HCV感染的献血者各项指标对比情况 表13、表14。表13 第1组8名HCV感染者近3年中各项感染指标检测结果对比表14 第2组19名HCV感染者近3年中各项感染指标检测结果对比表13结果表明，第1组HCV-RNA在近3年中已全部转阴;RIBA法检测HCV抗体结果，抗体均全部减弱，抗-HCV RIBA法检测结果同HCV-RNA检测结果有很好的相关性。抗-HCV ELISA检测结果，同HCV-RNA检测结果相关性较小。表14结果表明，第2组HCV-RNA结果则同抗-HCV检测结果高度一致(包括ELISA法与RIBA法结果)。 此外，表13、14结果表明，HCV感染后病情与HCV型别有明显关联性，第1组病变较轻，HCV多为Ⅲ/2a型(3/5);第2组病变较重，HCV多为Ⅱ/1b型(18/19)。
2.8 肝组织中HCV-RNA检测 用地高辛标记HCV C区cDNA探针检测7例HCV感染者肝组织中HCV-RNA。结果显示，6例同时检测血清抗-HCV和HCV-RNA均阳性的感染者中，5例肝组织检测到HCV-RNA，1例仅有抗-HCV阳性者，肝组织中未检出HCV-RNA。另1例血清抗-HCV阳性而HCV-RNA阴性者，肝组织HCV-RNA检测为阳性[8]。
2.9 HCV感染的献血者9名肝组织病检查结果 见表15。 9名HCV感染的献血者自愿做肝穿检查，根据肝组织炎症活动度和纤维化程度进行分级和分期[7]。结果9名感染者在HCV感染后15年6个月肝组织检查均为轻度慢性肝炎，病变程度为G1至G2级，纤维化程度为S0至S1期。病变程度同血清HCV-RNA、ALT、抗-HCV及HCV亚型均有明显相关性。表15 HCV感染的9名献血者感染15年6个月后肝组织病理检查结果
N0.2 G1 少量炎细胞(淋巴细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，无点状坏死，少数肝细胞小泡性脂肪变性 S0 无纤维增生 轻度慢性肝炎
N0.3 G1 少量炎细胞(淋巴细胞、单核细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死，少数肝细胞大泡性脂肪变性 S0 无纤维增生 轻度慢性肝炎
N0.18 G2 中等量炎细胞(淋巴细胞、单核细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死、轻度碎屑坏死 S0 无纤维增生 轻度慢性肝炎
N0.19 G1 少量炎细胞(淋巴细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死，部分肝细胞大泡性脂肪变性 S1 轻度纤维化 轻度慢性肝炎
N0.20 G2 中等量炎细胞(淋巴细胞、单核细胞、少许中性粒细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死、轻度碎屑坏死 S1 轻度纤维化 轻度慢性肝炎
N0.24 G2 中等量炎细胞(淋巴细胞、单核细胞、少许中性粒细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死、轻度碎屑坏死 S1 轻度纤维化 轻度慢性肝炎
N0.25 G2 少量炎细胞(淋巴细胞、少许中性粒细胞)浸润，钙化的血吸虫卵沉积 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死、轻度碎屑坏死 S1 轻度纤维化 轻度慢性肝炎
N0.29 G1 少量炎细胞(淋巴细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死 S1 轻度纤维化 轻度慢性肝炎
N0.30 G1 少量炎细胞(淋巴细胞)浸润 肝细胞水肿变性、气球样变，可见点状坏死 S1 轻度纤维化 轻度慢性肝炎
在这9名HCV感染的献血者中，第1组做肝活检3人，诊断G1S0 1人，G1S1 2人;第2组做肝活检6人，诊断G1S0 1人，G2S0 1人，G1S1 1人，G2S1 3人。第1组3名感染者病理检查肝病变均为HCV G1级(3/3)，说明病变较轻。第2组感染者6人检查肝组织病变，HCV G2级4人(4/6)，G1级2人(2/6)，可见第2组比第1组病变程度重。详见图1。
2.10 体格检查情况 27名HCV感染的献血者经15年追踪调查，均自述一般健康状况尚佳，能坚持正常生活与劳动。经多次血样检测，血清HBsAg和抗-HIV均阴性。近两年中发现有2人(No.28和No.4)梅毒试验转为阳性(RPR与ELISA法)，其余23名梅毒试验均阴性。肝脾B超检查发现部分人肝实质回声增强，少数肝脾肿大，但均无其他明显症状。
3 讨论
丙型肝炎病毒感染后易发展为慢性HCV感染或慢性丙型肝炎，从本研究组15年追踪观察资料可以得到证实。根据2000年9月西安会议制订的《病毒性肝炎防治方案》中的“病毒性肝炎诊断标准”，从本组27名HCV感染的献血者HCV-RNA、抗-HCV、肝组织活检、ALT等项检测情况来看，均可诊断为慢性轻度丙型肝炎。 HCV-RNA的动态变化趋势是预测HCV感染进程的重要指标。根据最后2次HCV-RNA检测结果和在15年中HCV-RNA长期的波动情况，将观察对象分为两组，第1组8例血样HCV-RNA检测为阳性的频率低，ALT异常率低，肝组织病变也较轻。第2组19例血样HCV-RNA检测为阳性的频率高，ALT异常率高，肝组织病变也较重。两组病情比较，第1组感染者8人可能处于HCV感染恢复阶段或稳定阶段。第2组感染者19人疾病可能有发展趋势。所以HCV-RNA的动态变化有助于了解HCV感染的疾病进程和预后，从而也可为进一步为制定治疗措施提供科学依据。本结果同Nalpas等人研究结果基本类似[9]。 本研究发现HCV-RNA结果和抗-HCV结果有很好的相关性。RIBA法检测为抗-HCV“不确定”的结果同PCR法测定的HCV-RNA阴性结果有明显相关性。RIBA法测定的抗-HCV阳性结果同PCR测定的HCV-RNA阳性结果符合率很高，所以RIBA试剂测定为阳性时可以确定为HCV感染。本组的这一结果同Follett等人的报道基本相似[10，11]。 关于HCV-RNA和抗-HCV的关系。HCV-RNA这一指标当今被公认为诊断HCV感染的金标准，因为其敏感性与特异性都很高。从本研究结果看，HCV-RNA检测尚不能代替抗-HCV检测，HCV-RNA在HCV感染的自然史中，经常有波动，常呈现间歇性阳性，而且HCV-RNA测定也有灵敏度及引物特异性的限制。抗-HCV可在血液中长期稳定存在，它是免疫反应的标志，也是HCV感染的标志，HCV-RNA阴性而同时抗-HCV阳性(RIBA法)的血液仍可能具有传染性，不能认为是假阳性，这一点已从肝组织检查结果得到印证。当然，如果抗-HCV ELISA检测为阳性而RIBA检测为阴性的结果可以判定ELISA结果为假阳性，因两法同为HCV抗体检测方法，RIBA法是ELISA的补充试验或确证试验。然而，从输血安全考虑，尽管抗-HCV-RIBA检测为阴性或不确定，或HCV-RNA检测为阴性，但血液仍不能输用。 关于HCV基因型与疾病进程的关系,已有文献报道[8，12]，本研究结果中第1组检测5人有3人为HCV Ⅲ/2a型。第2组检测19人，有18人为HCV Ⅱ/1b型，似乎可以说明HCV Ⅲ/2a型感染者病变比Ⅱ/1b型轻，预后情况较好。 关于丙型肝炎的防治。丙型肝炎传播的途径同乙型肝炎类似，但丙型肝炎更易通过血液传播，因此加强献血者血液的检测非常重要。根据文献报告[2]，20世纪90年代初是我国献血者中丙型肝炎传播的高峰期，单采血浆献血者中抗-HCV阳性率达24.4%(1942/7970)，后经过国家加强对献血队伍的整顿、采用机器采血浆和加强血液检测等措施，排除以往HCV抗体阳性献血者，使献血者中HCV感染传播迅速得到控制。现在的问题是如何对以往发生的HCV感染者进行治疗。我国《丙型肝炎防治指南》[13]已经出台，可供参考。丙型肝炎治疗有效的药物有多种，建议首先对血液长期HCV-RNA阳性和ALT异常或肝组织有严重病变的献血者进行适当抗病毒治疗，以防止慢性HCV感染的进一步发展。 (致谢：本研究工作得到四川省人民医院杜琼、姚绍琴医师，四川省什邡市人民医院杨翠、倪声全医师，什邡市血站刘家清、胡力医师，川大华西医院雷秉钧、陈立宇医师，以及汕头中心血站庄文医师的大力支持，特此致谢。)
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作者单位：本课题为美国CMB基金支持项目(编号：93-582) 1 610081 四川成都,中国医学科学院/北京协和医学院输血研究所(季阳，研究员，博士研究生导师。苑宇哲，博士。汪学纯，副研究员。史宣玲，博士，现在北京清华大学。曹凤，博士，现在美国圣路易斯大学) 2 四川成都，四川省人民医院病理科