DECB对超声乳化角膜内皮损伤修复的促进作用*

【摘要】  目的 研究小牛血去蛋白提取物（deproteinized extract of calf blood，DECB）作为白内障超声乳化术中冲洗剂和留置剂对角膜内皮细胞修复的促进作用。方法 采用12只纯种日本大耳白兔制作白内障超声乳化术动物模型，右眼为实验组，采用加入一定浓度DECB的BSS（必施）作为术中冲洗剂和术后留置剂，左眼对照组采用BSS（必施）为术中冲洗剂和术后留置剂。术前、术后即刻、术后6 h、1天、2天、3天、7天使用接触型角膜内皮反射显微照相系统定量分析内皮细胞平均面积(average size)、变异系数(coefficient of variability)、细胞密度(cell density)；术后即刻、1天、3天行内皮细胞锥蓝－茜素红联合染色，光镜下观察内皮细胞。结果 角膜内皮细胞面积、变异系数和内皮细胞密度比较，术后6 h、1天、3天，差异有统计学意义(P＜0.05)；术后1天、2天，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，内皮细胞密度0.01

【关键词】  小牛血去蛋白提取物；超声乳化术；角膜内皮；损伤修复；锥蓝-茜素红联合染色

    Deproteinized extract of calf blood effects corneal endothelium recovering at the phacoemulsification

    ZHANG Cui-ying，LIU Hua，MU Chang-zheng.Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China

    ［Abstract］  Objective  To study the influence of deproteinized extract of calf blood (DECB) in the phacoemulsification on corneal endothelium as rinse and detained agent.Methods  Twelve rabbits were made animal models by phacoemulsification，right eye were experiment group and left eye were control group.When the albino rabbits from experiment group were operated，the rinse and detained agent was BSS balance salt added DECB.when the albino rabbits from control group were operated，the rinse and detained agent was just BSS.Different time after operation observed corneal，corneal endothelium was quantitative analyzed through corneal endothelium image micrograph system.The  structure of corneal endothelium was observed by microscope.Results  Observed though microscope，cell morphous were better in the experiment group than that in control group.And the damage of corneal endothelium in experiment group was lighter.Quantitative analyzed by corneal endothelium image micrograph system，there were great difference between the two groups.The  experiment group healed faster.Conclusion  Deproteinized extract of calf blood would improve corneal endothelium healing at the phacoemulsification.

    ［Key words］  deproteinized extract of calf blood;phacoemulsification; corneal endothelium；wound healing；trypan blue united with alizarin bordeaux dyg

    自超声乳化治疗白内障以来，如何降低超声乳化过程中角膜内皮的损伤，一直是眼科医生探讨和研究的课题。随着手术仪器、手术方法的改进和黏弹剂的出现，其手术并发症越来越少，但必须承认，由于各种因素的影响，仍然存在发生并发症的可能。最常见的是由角膜内皮细胞损伤引起的术后角膜水肿、混浊，甚至是大泡性角膜炎，严重影响手术效果。本实验以含有一定浓度DECB的BBS作为超声乳化白内障吸除术术中冲洗剂和术后留置剂，术后观察内皮细胞的修复和再生，探讨DECB在超声乳化术中对角膜内皮细胞损伤的促修复作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料  日本大耳白兔12只(锦州医学院实验动物中心提供)，小牛血清去蛋白注射液(锦州奥鸿药业有限责任公司生产)，爱维（即：医用透明质酸钠凝胶，山东博士伦福瑞达制药公司生产），BSS（平衡盐灌注液，日本参天制药株式会社生产），茜素红（天津市大茂化学试剂厂生产），锥蓝（天津市光复精细化工研究所生产）。白内障超声乳化系统（sovereign），接触型角膜内皮反射显微照相系统（EM-1020），光学显微镜(Olympus)。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组  将12只日本大耳白兔右眼设定为实验组，左眼为对照组。

    1.2.2  动物模型的制作  使用美国sovereign超声乳化系统，常规显微手术器械，灌注液为平衡盐溶液及含100 μg/ml DECB的平衡盐溶液；设置恒定参数：乳化功率40％，负压33.25 kPa，（1 mm Hg=0.133 kPa），瓶高170 mm，乳化时间100 s。手术前，所有日本大耳白兔均用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，用盐酸奥布卡因点双眼表面麻醉角膜。用兔头固定器固定好，生理盐水冲洗手术眼，于上方角巩膜缘做切口，穿刺入前房，注入黏弹剂；扩大切口至3 mm超声乳化头置于中央区乳化吸出晶体核及皮质；手术结束后1 min自角膜缘处吸出0.1 ml房水，随后实验组将含有100 μg/ml DECB液的平衡盐0.1 ml注入前房；对照组将0.1 ml平衡盐注入前房。术后妥布霉素地塞米松滴眼液点双眼，2 h 1次。

    1.2.3  术后观察和检测方法  术后观察和检测方法有：（1）角膜内皮定量检测：被测兔角膜点盐酸奥布卡因后，应用日本Topcon公司生产的EM-1020型接触型角膜内皮反射显微照相系统对角膜中央区0.25 mm×0.37 mm范围进行照相，行角膜内皮细胞形态学定量测定；然后进行计数分析，观察时间为术前和术后即刻、术后6 h、1天、2天、3天、7天。测量指标为平均细胞面积(average size)、细胞变异系数(coefficient of variability)、细胞密度（cell density）。（2）角膜内皮形态观察：术后即刻、术后24 h、术后3天，分别处死4只兔，锥蓝-茜素红联合染色后观察内皮形态改变。

    1.3  统计学方法  采用SPSS11.5统计软件分析，组间比较采用独立样本的t检验，组内比较采用单因素方差分析q检验。

    2  结果

    2.1  角膜内皮定量观察  术前、术后即刻、术后6 h、1天、2天、3天、7天进行角膜内皮细胞定量分析。实验组和对照组在各个时间点进行比较，使用SPSS 11.5统计软件分析细胞平均面积，组间比较采用独立样本的t检验，结果表明：术后6 h、1天、2天、3天同时间比较，差异有显著性（P<0.05）；实验组术后2天和对照组术后7天差异无统计学意义(P>0.05)。组内比较采用单因素方差分析q检验，实验组术后3天与术前差异无统计学意义（P>0.05），而对照组术后7天方能修复到和术前差异无统计学意义(P>0.05)。

    变异系数组间比较采用独立样本的t检验，结果表明：术后6 h、1天、2天、3天同时间比较差异有统计学意义（P<0.05）；实验组术后3天和对照组术后7天差异无统计学意义(P>0.05)。组内比较采用单因素方差分析q检验，实验组术后3天和术前差异无统计学意义（P>0.05），而对照组术前和术后各个时间点差异均有统计学意义（P<0.05）。

    细胞组间比较采用独立样本的t检验结果表明，术后6 h、1天、2天、3天同时间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组术后3天和对照组术后7天差异无统计学意义(P>0.05)。组内比较采用单因素方差分析q检验，实验组术后3天和术前差异无统计学意义（P>0.05），对照组术后7天和术前差异有统计学意义(P<0.05)。其比较结果见图1、图2、图3。

    由图1、图2、图3和统计分析可以明显看出，整个修复过程中实验组的内皮细胞面积小于对照组，变异系数小于对照组，内皮细胞密度大于对照组。显而易见，实验组的内皮细胞修复好于对照组，说明DECB可以促进内皮细胞的修复。

    2.2  角膜内皮形态观察  术后即刻观察照相，内皮细胞呈规则的六边形镶嵌结构，边界清晰，可见连接复合体和缝隙连接；术后1天实验组角膜内皮细胞出现六边形细胞的不规则改变和水肿，突起增多，细胞核无蓝染；对照组亦出现六边形细胞的不规则改变和水肿，突起增多，边界不清晰，可见胞核蓝染和崩解的内皮细胞。术后3天两组细胞都只见细胞六边形的轻度不规则改变和水肿。

    3  讨论

    兔角膜内皮细胞受损后不但可以通过细胞的移行、扩大和融合来修复，还可以通过细胞的有丝分裂来修复。Yano M和Tanishima T［1］研究表明，兔眼的角膜内皮细胞受损后6 h方可检测到内皮细胞的有丝分裂，24～48 h有丝分裂达到高峰；其扫描电镜研究表明，在活体或组织培养下直径4 mm的内皮损伤也可在3天之内修复。故本实验观察术后7天内角膜内皮细胞的变化可以准确反应超声乳化术对角膜内皮细胞的损伤及修复情况。内皮细胞平均面积和内皮细胞多形性程度的增加反映了内皮细胞储备功能的下降，即从创伤过程中恢复角膜生理状态的能力下降。本实验用接触型角膜内皮反射显微照相系统对角膜内皮进行照相，针对细胞平均面积、变异系数和细胞密度进行比较和分析细胞损伤和修复情况。术后1天和2天对照组2个样本出现片状黑区，考虑可能是内皮突起不平所致，也有可能是角膜混浊所致。组间比较和组内比较统计分析结果表明：实验组内皮细胞损伤修复比对照组快。内皮细胞定量分析论证了一定浓度的DECB加入BSS中能够促进超声乳化术对角膜内皮损伤的修复。锥蓝是一种生物细胞活性染料，主要对细胞核发生着色反应，对有活性的细胞核不着色，茜素红为一种神经细胞活性染色剂，依赖细胞间隙中钙的红染反应，与细胞间隙有很好的色染，能清晰地显示细胞的形态［2］。本实验中，应用锥蓝－茜素红联合染色后光镜观察显示：术后实验组角膜内皮细胞损伤较轻、修复较快。

    角膜内皮细胞对周围环境的变化极为敏感，超声乳化术中理想灌注液的应用也就显得更加重要。目前眼内灌注液种类很多，处方和质量参差不齐、特征各异，但是都以减少术中眼内环境的改变所造成的眼内组织损伤为目的，国内外尚没有出现对眼内组织损伤小且能够促进内皮细胞修复的灌注液。循环的房水为角膜内皮提供了最佳外环境，任何灌注液都难以比拟。因此理想的灌注液应具有下述特点：(1)含钾、钠、钙、氯、镁、碳酸氢根等角膜内皮生存所需的最基本离子成分；(2)含有为细胞代谢提供能量的葡萄糖；(3)有维持酸碱度稳定的缓冲系统；(4)与体液等渗；(5)含有还原型谷胱甘肽及腺苷；(6)耐高温消毒，易于配制保存。

    术中使用的BSS灌注液由日本参天制药生产，主要成分有氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、醋酸钠、柠檬酸钠，用来调节酸碱度的氢氧化钠和盐酸等。BSS在化学成分上具备了Na+、K+、Ca2+、Cl-、Mg2+等基本离子和维持酸碱度的枸橼酸盐－醋酸盐缓冲系统。BSS与理想灌注液的差别在于：其中不含有葡萄糖、还原型谷胱甘肽和腺苷。（1）DECB是从幼牛静脉血、胎肝、胸腺中经纯化、提取、超滤等工艺制成的去蛋白小分子制剂，其主要成分为无机离子(K+、Cl-、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+等)以及氨基酸、小分子肽(分子量小于5000D)、核苷酸、低聚糖、脂类等小分子有机物［3］。DECB中含有小分子多肽（可能包括谷胱甘肽）。细胞内一定量的谷胱甘肽可以防止细胞内ATP过度消耗，通过形成DNA的前体-脱氧核苷酸来调节蛋白质的合成、降解和发挥控酶作用，从而维持细胞内环境的稳定；而且不破坏血-房水屏障(blood-aqueous humor barier，BAB)。Araie［4］等在体外实验中观察含谷胱甘肽和不含谷胱甘肽的灌注液对角膜内皮屏障功能影响；结果显示，含有谷胱甘肽的溶液对角膜内皮屏障功能损害比不含谷胱甘肽的轻，且还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)都可维持内皮细胞正常的屏障和泵功能［5，6］。（2）DECB中含有葡萄糖和多种核苷酸直接为细胞代谢提供能量物质，并且葡萄糖能显著提高内皮细胞中谷胱甘肽的水平。（3）磷酸肌醇寡糖被认为起胰岛素受体后第二信使的作用，可促进葡萄糖的摄取和利用。本实验研究结果表明：超声乳化术中以含一定浓度DECB的BSS作为术中冲洗剂和术后留置剂能促进角膜内皮细胞损伤的修复可能与上述原因有关。

【参考文献】
  1 Yano M，Tanishima T.Wound healing in rabbit corneal endothelium.Jpn Opthalmol，1980，24：297-309.

2 赵江月，曲勃，陈琳琳，等.不同染色剂对兔眼角膜内皮细胞影响的研究.眼科新进展，2005，25（4）：335-337.

3 于鸿儒，肖建英，刘用璋，等.小牛血去蛋白提取物的生化性质及药效学的实验研究.药物生物技术，1998，5(1)：34-37.

4 Araie M.Barrier function of corneal endothelium and the intraocular irrigating solutions.Arch Ophthalmol，1986，104(3)：435－438.

5 Whikehart DR，Edelhan ser HF.GIutathione in rabbit corneal endothelia：the efects of selected perfusion fluids.Invest Ophthal Visual Sci，1978，17：455-464.

6 Riley M.Pump and leak in regulation of fluid transport in rabbit cornea.Curt Eye Res，1985，4：371-380.

作者单位：121000 辽宁锦州，辽宁医学院