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【摘要】 目的 探讨使用不同剂量可卡因对大脑皮层神经元细胞凋亡的影响。 方法 实验组每日分别给妊娠Wistar大鼠皮下注射不同剂量的盐酸可卡因15天。对照组每日给予相同剂量的普通生理盐水15天。在可卡因使用的第15天分别取胎鼠大脑皮层组织，用原位缺口末端标记（TUNEL）法、流式细胞术（FCM）检测大脑皮层神经元细胞凋亡。 结果 在使用可卡因15mg/kg和25mg/kg组出现细胞凋亡，同对照组相比差异有非常显著性（P<0.01），而1.5mg/kg组未出现细胞凋亡。 结论 使用大剂量可卡因可以导致胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。
关键词 可卡因 神经元 凋亡
Cocaine induced cell apoptosis in cortical neurons of fetal mice
Wu Lanying，Wang Hua，Shen Chaobin，et al.
Department of Pediatrics，Shanghai Traditional&Western Medicine Integrated Hospital，Shanghai200082.
【Abstract】 Objective To investigate the role of cell apoptosis induced by cocaine with different doses.Methods Pregnant Wistar rats in experimental group were given cocaine hydrochloride with different doses according to body weight（Subcutaneously injected for15days）.Control animals received physiological saline of equal volumes for15days.Cortical tissues of fetal mice were removed after15days in two groups.TUNEL（In situ nick end-labelling）assay was carried out to detect cell apoptosis，FCM（flow-cytometry）assay was carried out to detect cell apoptosis in cortical neu-rons of fetal mice.Results The number of apoptotic cells was significantly increased in cocaine exposure at doses of15mg/kg and25mg/kg，it were significantly different than the controls（P<0.01）.But that at a dose of1.5mg/kg did not expressed apoptosis.Conclusion The experimental results suggest that cocaine exposure at big doses lead to signifi-cant apoptosis in cortical neurons of fetal mice.
Key words cocaine neuron apoptosis
据报道在大多数北美的城市中有6%～15%的孕妇可卡因成瘾，近年来国内一些地区也存在孕妇吸毒问题。虽然可卡因对胚胎大脑的致畸作用已充分阐明，但对神经发育过程中出现的混乱仍存在争议。笔者通过动物实验，探讨使用可卡因对胎鼠大脑皮层神经元细胞的损害。
1 材料与方法
1.1 动物分组 将妊娠Wistar大鼠20只，置于室温（20±2）℃的清洁级动物室中，自由进食饮水。将其分成两组:实验组和对照组。实验组共15只妊娠Wistar大鼠，分实验组A、实验组B、实验组C，每组5只妊娠Wistar大鼠。给实验组A、B、C每组大鼠分别皮下注射溶解于0.2ml蒸馏水中盐酸可卡因（青海制药厂）1.5mg/kg、15mg/kg、25mg/kg，后两者为重度可卡因服用者的剂量 ［1］ 。每天给每只大鼠称重1次，根据体重调整盐酸可卡因的剂量。对照组5只妊娠Wistar大鼠每天给0.2ml普通生理盐水。此处理持续15天。从每只妊娠Wistar大鼠中分别取出存活的胎鼠3只（死亡除外）。并取大脑皮层组织做检测。每组胎鼠各15只。
1.2 原位缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡 各组所取组织用10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡切片。原位细胞凋亡检测试剂盒（POD）购自德国BOCKINGER MANNHEIM公司，蛋白酶K为Sig-ma公司产品，按试剂盒说明进行检测。结果评定标准:凋亡细胞呈棕黄色颗粒状，位于凋亡细胞核内。光学显微镜观察任意10个视野（400倍）并计算凋亡率。
1.3 FCM测定 分别取实验组和对照组脑组织，制成细胞悬液，于4℃1500r/min离心，5min。弃上清，加入溶红细胞液（7g/L氯化铵，2.6g/L Tris-HCl）1ml，4℃1500r/min离心，5min。弃上清，加入70%（体积分数）冷乙醇200ml，重悬，于4℃过夜。4℃1500r/min离心，5min。弃上清，用0.1mol/L PBS（无钙、镁离子）洗涤1次，加入RNaseA（20g/L），于37℃孵育30min，室温1500r/min离心，5min。弃上清，用PBS重悬，加PI液50μl混合，于室温暗处放置，30min内测定。使用COULTER EPICS-XL型流式细胞仪，光源为氩离子激发器，功率为15mW，激发光波长为488nm，测定10000个细胞，细胞荧光信号被送入脉冲高度分析仪并在荧光屏上显示，同时将测定数据输入PHOENIX FLOW SYSTEMS MULTICYCLE VERSION4.0进行数据分析。
1.4 统计学方法 使用SPSS11.0软件，采用t检验。
2 结果
2.1 原位缺口末端标记（TUNEL）法检测 大脑皮层神经元细胞凋亡率为:实验组A5.2%，实验组B20.6%，实验组C23.5%，对照组4.5%。实验组A和对照组比较差异无显著性（P>0.05）。实验组B和对照组比较差异有非常显著性（P<0.01），实验组C和对照组比较差异有非常显著性（P<0.01）。表明小剂量的可卡因不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，大剂量可卡因可以诱导胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。
2.2 FCM分析 细胞分布直方图显示，正常脑组织主要由两类细胞组成，按DNA含量排列在相应的峰道数内，故可见如下3个峰。第1个峰为2C峰（二倍体DNA的细胞群），第2个峰为S期的峰，第3个峰为4C峰（四倍体DNA的细胞群）。FCM分析显示对照组和实验组A分布直方图均以2C峰为主，其次为4C峰。在2C峰之前几乎没有明显的细胞分布（图1）。而实验组B、C胎鼠脑细胞分布直方图则有显著改变。在2C峰之前出现一个明显的小峰，为断裂的DNA，代表了凋亡的细胞数量（图2），为亚二倍体的DNA。并且亚二倍体的DNA含量随可卡因剂量不同而变化，见表1。
表1 分析实验组和对照组中凋亡细胞 （略）
注:组间比较: * P<0.05， Δ P>0.05
图1 对照组胎鼠大脑皮层神经元细胞中仅少量不明显亚单倍体DNA（略）
图2 15mg/kg组胎鼠大脑皮层神经元细胞中亚单倍体DNA明显增多（略）
3 讨论
笔者用TUNEL法检测细胞凋亡。TUNEL法是Gaviel等1992年根据细胞凋亡时DNA断裂的特征而设计的DNA链断端标记技术。它是在末端脱氧核苷酸转移酶的介导下，将生物素化的尿苷三磷酸与DNA链断端结合形成多聚体，再与单克隆抗生物素抗体上多聚体结合。这种结合反应具有特异性，能准确反映DNA断裂的存在，能在单个细胞内观察DNA断端，细胞凋亡发生早期即可用此方法检测出来。通过TUNEL法证明，注射1.5mg/kg小剂量可卡因不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，而注射15mg/kg、25mg/kg剂量的可卡因可以使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。
用流式细胞术评价在凋亡过程中细胞浆失水，核染色质浓缩及减少。几分钟内它可在一个至数千个不等的细胞中得到有价值的数值。从胎鼠脑细胞分布直方图研究分析显示:使用不同剂量可卡因，对胎鼠脑细胞可产生不同的影响，并且证明注射小剂量的可卡因（1.5mg/kg），不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，而15mg/kg、25mg/kg剂量的可卡因可以使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。
可卡因分子量低，并且为两性分子，它被人和动物母体摄取后能迅速通过胎盘屏障进入胚胎中，并可通过血脑屏障到达脑组织中 ［2］ 。笔者就是利用可卡因对胎鼠大脑皮层神经元细胞影响的这种特性来进行研究的。在研究中，证明小剂量的可卡因不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，大剂量的可卡因可以使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。正如Nas-sogne等学者所证实 ［3］ ，可卡因通过细胞凋亡引起幼鼠大脑皮层神经元的细胞死亡。Cascales也证实可卡因导致一群细胞死亡是通过凋亡程序进行的。笔者通过动物实验更进一步证明这种死亡是通过凋亡程序完成的。
胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，可能归因于可卡因本身和（或）其代谢产物的作用。可卡因作为一种麻醉剂通过与细胞内的Na + 、K + 、Ca 2+ 通道结合来干扰这些离子的跨膜运动，而在一些实验中改变胞浆中的Ca 2+ 浓度对于凋亡的早期信号传导起着很重要的作用;可卡因能激活中性鞘磷酯酶，导致神经酰胺积累，通过生化途径诱导凋亡;在胎鼠脑细胞发育的胚胎阶段，可卡因可能激活fos、c-jun、zif268基因，这些基因已被证实在特定的形式下诱导细胞凋亡 ［4］ 。已经证实可卡因代谢期间及由可卡因引起的再灌注的损害期间可产生活性氧（ROS），ROS可激活细胞凋亡，但ROS在组织中的浓度却很难确定 ［5］ 。Haikun等研究发现两个相关联的因素:证实还原型谷胱甘肽（GSH）水平的降低以及服用可卡因后过氧化脂的增加，可能与细胞凋亡有关;另外可卡因可以直接作用于组织，产生大量去甲肾上腺素和肾上腺素，导致血管强烈收缩，影响胎鼠脑细胞血供，诱导局部缺血缺氧从而使胎鼠脑细胞凋亡 ［6］ 。总之，可卡因如何诱导胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡机制有待进一步研究。
参考文献
1 King T S，Schenken R S.Cocaine disrupts estrous cyclicity and alters the reproductive neuroendocrine axis in rats.Neuroendocrin，1990，51:15.
2 ZiniA，Abitol J，Girardisk，et al.Germ cell apoptosis and endothelial fol-lowing nitric oxide synthase（Enos）expression following ischemia-reper-fusion injury to testis.Arch Androl，1998，41:57-65.
3 Nassogne MC，Evrard P，Courtoy PJ.Selective direct toxicity of cocaine on fetal mouse neurons.Ann N Acad Sci，1998，21:51-68，846.
4 Mitchell ES，Snyder-keller A.Blockade of D1dopamonergic transmission alleviates c-fos induction and cleaved caspase-3expression in the brain of rat pppups exposed to prenatal cocaine or perinatal asphyxia.Exp Neu-rol，2003，182（1）:64-74.
5 Korutla L，Neeustadter JH，Fournier KM，et al.NAC1，a POZ/BTB protein present in the adult mammalian brain，triggers apoptosis after adenovirus-mediated overexpression in PC-12cells.Neurosci Res，2003，46（1）:33-39.
6 刘剑新，白进良，傅梧，等.在可卡因诱导下大鼠阴茎细胞凋亡与雄激素的关系.中华医学杂志，2001，17:1084-1085.
（编辑云 兆）
作者单位:200082上海市中西医结合医院儿科