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［摘要］随着国内外学者对病毒性心肌炎发病过程的重视程度增加，关于病毒在心肌炎的发病过程中对线粒体的损伤机制研究不断发展。现已发现病毒能够通过直接损害、免疫损害、氧自由基损伤使心肌线粒体的结构和功能发生改变，进而引起线粒体钙超载、线粒体呼吸链功能障碍、线粒体凋亡、线粒体DNA损伤，最终使ATP合成受阻，心肌能量供应不足;膜离子运输系统紊乱，心肌异常电位产生;心肌细胞凋亡调控系统激活，心肌凋亡发生。
［关键词］ 病毒，心肌炎;线粒体；儿童
近年来病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）发病率明显增长，在小儿心肌炎中占重要地位。VMC的病理特征为心肌细胞的坏死或变性，有时病变也可累及心包或心内膜。线粒体的含量占心肌细胞容积的35％～40%［1］，不仅承担着心肌90%的能量供应，而且在调节细胞内Ca2+浓度、细胞凋亡的发生等方面起着重要作用。现结合国内外文献，对线粒体损伤在病毒感染所致的心肌损害中具体机制及效应综述如下。
1 损伤机制
1.1 病毒的直接损害
VMC急性期病毒通过心肌细胞的相关受体侵入心肌细胞，在细胞内复制，溶解细胞后得以扩散。在病毒感染过程中，吸附穿入细胞及扩散出细胞都会对细胞膜、线粒体膜造成直接损伤［2］，引起线粒体内膜上Ca2+-ATP酶的活性下降、线粒体钙化。有研究报道，在病毒性心肌炎早期，即病毒损伤期，造成心脏功能下降的原因主要是心肌细胞超微结构改变，特别是线粒体超微结构发生了变化，使心肌细胞供能障碍［3］，心肌收缩力减小［4］，陈建斌等［5］采用电镜和形态计量学方法观察心肌线粒体形态、数量和膜磷脂定位,用酶细胞化学法分析心肌线粒体细胞色素氧化酶（CCO）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性。结果发现IG小鼠心肌线粒体大量破坏,CCO和SDH活性降低,膜磷脂严重缺失、定位改变（P＜0.01或P＜0.05）。徐敏源［6］发现一种RNA病毒颗粒（直径30 nm） 聚集在大肠癌细胞线 粒体内，破坏线粒体的嵴结构，导致线粒体空化。笔者所查文献未见报道心肌线粒体内发现病毒颗粒。
1.2 免疫损害
VCM后期，主要是由受损心肌引起的免疫病理过程［7］大量细胞因子的释放可增强心肌细胞黏附分子ICAM-1的表达［8，9］，促进炎性细胞的趋化，介导细胞凋亡的发生。引起心肌局部缺血、缺氧，氧自由基水平升高，心肌细胞坏死、凋亡。
Schultheiss等［10］首先发现DCM患者血清中存在抗心肌线粒体腺苷酸转位酶（抗ANT抗体），自身抗体在VMC和DCM发病的作用受到关注。心肌线粒体腺苷酸转位酶（ANT）成为自身抗原的原因是ANT与病原体蛋白存在有共同的抗原决定簇,如ANT氨基酸序列27～36和柯萨奇B3病毒蛋白氨基酸序列1218～1228相似,可通过共同的交叉反应性引起自身抗体的产生。研究表明，抗ANT抗体能抑制心肌ANT的ATP/ADP转运,导致心肌细胞能量代谢障碍,损伤心肌功能［11］。同时通过交叉免疫作用使心肌细胞膜钙通道功能异常,导致细胞内钙超载,心肌细胞变性、坏死［12］。
万学敏等［13］建立了自身免疫损伤的离体心肌细胞模型,在此基础上进行了心肌细胞的细胞力学的特性分析。以心肌细胞最大收缩速度（Vmax）,收缩末期时心肌细胞面缩小的百分率（ΔSmax）以及心肌细胞长度缩短的百分率（ΔLmax）,表示了心肌细胞面积以及心肌细胞长度大小,它反映了心肌细胞内在收缩力的大小。自身免疫损伤的离体心肌细胞收缩力的参数都发生了改变。在没有心室压力负荷的条件下,心肌细胞收缩速度的减慢,表明了内在心肌细胞的功能下降和收缩力减弱，在免疫损伤的心肌细胞,收缩力参数Vmax、ΔSmax和ΔLmax值均明显下降。
1.3 氧自由基损伤
正常心肌代谢可产生高活性物质，即所谓的活性氧：超氧化物阴离子自由基（O-）、羟自由基（·HO）、过氧化氢（H2O2）等。机体内90%以上的氧耗与线粒体呼吸系统有关，线粒体呼吸链在传递电子、使O2还原为H2O的过程中，一部分电子漏出，自氧化一种或多种还原物资产生少量的H2O2和超氧阴离子等自由基。自由基性质活泼，极易与其他物质发生反应而形成新的自由基或活性氧化产物（reactive oxygen species,ROS），且其反应往往呈连锁性。自由基可以和膜磷脂、蛋白质、核酸等多种细胞成分发生反应，破坏细胞的结构和功能，造成细胞损伤。
1.3.1 膜脂质过氧化（lipid peroxidation）
生物膜（细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜和内质网膜）是活性氧攻击的主要部位。生物膜的主要成分是极性脂质（磷脂、胆固醇）和膜蛋白（酶、受体、离子通道等）。膜磷脂富含多价不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化（见图1略）。
1.3.2 发生机制 （1）细胞膜结构破坏：质膜脂质过氧化使细胞膜不饱和性改变，继之发生膜流动性降低、脆性增加、受体失活、离子通道变构、酶活性改变，从而引起细胞功能和结构变化（见图2）。（2）细胞器膜结构破坏：①溶酶体破裂释放溶酶体酶，引起细胞结构损坏；②线粒体肿胀、功能障碍，产能减少；③肌浆网Ca2+-ATP酶活性降低使摄取的Ca2+减少，导致细胞内钙超负荷；（3）脂质信号分子生成异常（见图3）。肌醇磷脂PI的脂质过氧化会使前列腺素（PGs）、1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG）等生成障碍，导致细胞信号转导异常。
病毒血症使氧自由基生成增加及其引发的脂质过氧化水平增强，其原因主要有:（1）激活黄嘌呤氧化酶途径［12］。病毒感染引起线粒体膜结构的紊乱，影响生物氧化进行，抑制ATP生成，ATP不足激活了腺苷酸激酶，催化2ADP→ATP+AMP［14］。AMP的分解导致黄嘌呤在体内蓄积，为黄嘌呤氧化酶提供充分的底物。黄嘌呤氧化酶能转化O2为O-和H2O2。（2）中性粒细胞趋化聚集，呼吸爆发，产生大量ROS。（3）局部缺血缺氧使线粒体KATP通道开放［15］，产生的K+内流可使质子泵形成的膜电位解离，加速呼吸链电子传递而伴随ROS泄露出线粒体［16］。
2 损伤效应
2.1 线粒体钙超载
2.1.1 Ca2+进入胞液的途径
（1）质膜钙通道：质膜钙通道主要有两类：一类是电压依赖性Ca2+通道（voltage operated calcium channels，VOC），当膜电位达到一定程度时开放，使细胞外的Ca2+进入细胞内。另一类是受体操纵性Ca2+通道（receptor operated calcium channels，ROC）,又称配体门控Ca2+通道。当与激动剂结合后开放，使细胞外的Ca2+进入细胞内。（2）细胞内钙库释放通道：细胞内游离Ca2+主要储存于内质网/肌浆网中，通过IP3敏感和不敏感的通道释放到胞浆中。
2.1.2 Ca2+离开胞液的途径
（1）Ca2+泵的作用：Ca2+泵即Ca2+-ATP酶，其活性依赖Ca2+和Mg2+，存在于细胞膜、内质网膜和线粒体膜上。当［Ca2+］升高到一定浓度时，Ca2+泵被激活，将Ca2+逆浓度梯度泵出细胞或泵入细胞器，降低细胞内Ca2+浓度。（2）Na+-Ca2+交换：Na+-Ca2+交换载体是一种非耗能的转运方式，转运方向为双向性。生理情况下，细胞外Na+浓度高于细胞内，Na+通过Na+-Ca2+交换载体顺电化学梯度进入细胞，Ca2+逆电化学梯度移出细胞，一般是3个Na+交换1个Ca2+（见图4略）。
已知线粒体膜上存在多种钙转运系统［17，18］，其中将胞浆钙转运入线粒体的是Ca2+泵、钙单向输送体（uniporter）和Ca2+-HPO-4同向转运体（symport），而将线粒体钙转运到胞浆的是Ca2+-2H+交换或Ca2+-2Na+交换系统。当胞浆内钙离子浓度增高时可通过线粒体膜上的单向输送体和同向转运体将Ca2+转移到线粒体内储存;当胞浆内钙离子浓度降低时，通过Ca2+-2H+交换或Ca2+-2Na+交换系统将Ca2+转移至胞浆。线粒体对心肌细胞内钙离子浓度起着“调节器”的作用。
病毒感染在直接导致细胞损伤的同时，亦引起细胞膜离子运输系统的紊乱，郭棋等［19］报道:CVB3感染心肌致细胞的钙通道开放，使细胞外Ca2+内流，引起钙超载。心肌细胞局部缺血缺氧可加重这一过程［20］。
细胞内钙超载是心肌细胞损伤的中心环节和心肌功能损害的重要原因，主要机制为:（1）线粒体功能障碍。氧化性损伤使大量Ca2+涌入细胞，触发线粒体摄取Ca2+，线粒体Ca2+浓度过高可激发病理状态导致细胞死亡［21］;（2）激活钙依赖性磷脂酶，促进膜磷脂分解［22］，引起线粒体膜损伤，改变其通透性;（3）激活钙依赖蛋白酶，降解胞内的许多酶及细胞骨架成分，使细胞内无害的黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，后者参与自由基的生成;（4）激活钙依赖性核酸内切酶，引起DNA水解，阻断了胞内依靠转录而进行的潜在修复过程;（5）激活一氧化氮合成酶（NOS）［23］，使NO和O-生成增多，导致细胞的氧化性损伤和凋亡，使细胞进入不可逆的恶性循环中（见图5略）。
2.2 线粒体呼吸功能障碍
线粒体内膜是合成ATP的关键场所。它含有高比例的心磷脂，这被认为是造成离子极不易渗透的原因。内膜的这种相对不通透性对于合成ATP所需的质子梯度的建立和维持十分必要。内膜的蛋白成分主要是5个酶复合物:NADH脱氢酶（复合物Ⅰ），琥珀酸脱氢酶（复合物Ⅱ），辅酶Q细胞色素氧化酶（复合物Ⅱ），细胞色素C氧化酶（复合物IV）,ATP合成酶（复合物V），每个复合物都是线粒体内膜的固有成分［1］。
缺血缺氧是影响线粒体呼吸功能的一个重要因素［24］。持续缺血5～7 min，内膜（呼吸链）和功能就会发生不可逆改变。细胞色素C氧化酶（CCO）即复合物Ⅳ是呼吸链的标志酶，它是唯一将电子传递给氧分子的细胞色素，是线粒体呼吸代谢与氧的连接处，它与琥珀酸脱氢酶同为线粒体呼吸酶系的关键酶，其活力受缺血缺氧的影响最大，直接影响线粒体氧化磷酸化过程。
一氧化氮（NO）是影响线粒体呼吸功能的另一个重要团素。NO是一种内皮细胞松弛因子和神经传递因子，也是一种细胞毒性物质［25］。线粒体内含有NOS类似物［26］，缺血条件下，NOS活性增强，NO产生增多。NO一方面可直接抑制辅酶Q细胞色素氧化酶、细胞色素C氧化酶的活性而影响细胞能量代谢［23］;另一方面，NO还可与同时生成的氧自由基形成氮氧阴离子ONOO-,损伤线粒体结构（见图6略），甚至诱发线粒体通透性转换导致细胞死亡［27］。
2.3 心肌细胞凋亡
线粒体PT孔（permeability transition pore）主要由位于内膜的腺苷转位因子（adenine nucleotide translocator，ANT）和位于外膜的电压依赖性阴离子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）等蛋白所组成，PT孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和细胞色素C释放。线粒体通过形成通透性转变孔道，丧失膜电位，释放内容物，激活细胞凋亡，但同时，线粒体的这一变化也将导致细胞坏死。如果线粒体PT孔道的诱导生成是一种比较缓和与持续的状态，在细胞ATP浓度下降前专一的蛋白酶被激活；如果线粒体短时间内有大量PT孔道形成，细胞ATP浓度很快下降，则在致凋亡的蛋白酶被活化前细胞就坏死了。因此，决定细胞凋亡和坏死的部分原因是ATP的状态。另一方面线粒体膜电位的耗散产生的超氧阴离子也将导致细胞死亡。正常状态下，许多具有细胞凋亡调控功能的蛋白质定位于线粒体膜间隙［27］，如蛋白激酶A、A-RAF-1激酶、接头蛋白Crb10,CIDEB、电位依赖性离子通道（VDAC）和腺苷酸易位酶（ANT）。蛋白DAP-3是一种核苷酸结合蛋白，定位于线粒体基质，它的表达多见于由干扰素α、CD95和肿瘤坏死因子（TNF）诱导的凋亡中。一些促凋亡的Bcl-2同源物，如BNIP3或BAK则松散地连于线粒体膜上，当受到促凋亡信号刺激时，能完全嵌入线粒体膜内以促进凋亡发生。病毒感染可在短期内致心肌线粒体结构改变——肿胀、囊泡化、甚至溶解破坏［28］、线粒体外膜破裂、膜间隙蛋白释放入胞浆，是生物大分子降解和凋亡的关键。具体机制:（1）细胞色素一旦移至胞浆中，在ATP的参与下与凋亡蛋白水解酶活化因子（Apaf-1）结合，促进Apaf-1之间的相互聚合，并与Caspase-9前体形成复合物（即凋亡小体），使其激活。活化的Csspase-9再激活下游的效应酶如Caspase酶原-3和Caspase酶原-7等，进而诱发凋亡反应［29］。（2）细胞凋亡诱导因子（AIF）从膜间隙首先转移到细胞质中，进而进入细胞核。体外实验发现，AIF可以引起纯化的胞核中的染色质异常凝集和DNA的大规模片段化［30］。
细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素C释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素C能与Apaf-1、caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡体（apoptosome，见图7），然后召集并激活caspase-3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。
由于大部分凋亡细胞中很少发生线粒体肿胀和线粒体外膜破裂的现象，所以目前普遍认为细胞色素是通过线粒体PT孔或Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道释放到细胞质中的。
Bcl-2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作用，促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放，而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、BclxL等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合，或者直接阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。
Bcl-2家族的结构与能形成离子通道的一些毒素（如大肠杆菌毒素）非常相似。插入膜结构中形成较大的通道，允许细胞色素C等蛋白质通过，这可能是细胞色素C释放的另一个途径。
近年来的研究发现，随细胞色素C释放的蛋白还有Smac（second mitochondriaderived activator of caspase）、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和核酸内切酶G（ Endo G）。Smac能通过N端的几个氨基酸与IAPs（凋亡抑制蛋白）的BIR结构域结合，从而解除IAP对caspase的抑制；AIF则引起核固缩和染色质断裂；Endo G可以使DNA片段化。可见，即使在caspase不参与的情况下，由线粒体途径仍可引起细胞凋亡。
在对Fas应答的细胞中，Ⅰ型细胞（type Ⅰ），如胸腺细胞，其caspase-8有足够的活性，被Fas活化后导致细胞凋亡，在这类细胞中高表达Bcl-2不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在Ⅱ型细胞（type Ⅱ），如肝细胞中，Fas介导的caspase-8活化不能达到足够的水平，因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途径来放大。活化的caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid（truncated Bid），tBid进入线粒体，导致细胞色素C释放，使凋亡信号放大。
除了上述凋亡相关因子以外，线粒体至少还能释放60多种膜间隙蛋白，通过非caspase依赖性途径介导细胞死亡［31］。
2.4 线粒体DNA（mtDNA）损伤
mtDNA呈闭环双链状，独立存在于核外。每个细胞含数百个线粒体，每个线粒体含2～10个基因组DNA。人类mtDNA含16569 bp，其全部序列已被测定。它包含22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白质基因［32］。与核DNA相比，mtDNA在结构和功能上有着自己独特的特征：（1）mtDNA是裸露的，缺乏组蛋白和DNA结合蛋白的保护；（2）mtDNA与氧化磷酸化场所（线粒体内膜）相距甚近，又直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧中，因此极易受自由基的攻击；（3）mtDNA复制快速且催化复制的DNA聚合酶γ不具有校读功能，复制错误率高；（4）mtDNA与核DNA相比缺乏有效的修复机制；（5）每个细胞中含有数百个线粒体，每个线粒体含多个DNA分子，所以细胞中可同时存在正常的mtDNA和突变的mtDNA，即异质性；（6）mtDNA无内含子，所以mtDNA的突变很容易影响到其基因组内的一些重要功能区域；（7）突变的mtDNA是否在组织产生表型效应，这要依突变mtDNA与正常mtDNA相对比例和该组织对线粒体产生的ATP依赖程度而定；（8）线粒体是半自主性细胞器，mtDNA基因的复制、转录和翻译受核DNA的制约；（9）线粒体位于胞质中，故mtDNA的遗传方式是细胞质遗传（母系遗传）。自由基主要来源于线粒体氧化磷酸化过程，它是指任何含有一个或多个不成对电子并能独立存在的基因，如H、O-、OH、RO、RO2、NO等。约1%～2%线粒体呼吸链消耗的氧被转化为O-2，CoQ与NADH脱氢酶是这一转化过程发生的主要位点［33］；来源于线粒体外膜的单胺氧化酶-A/B对生物胺的氧化可以产生H2O2，这比复合物Ⅱ介导的琥珀酸氧化生成H2O2量要高48倍［34］。由于Cu可在氧化态和还原态之间反复改变，所以它是一种较强的致氧化剂（prooxidant），可产生OH等自由基，同时Cu能够形成CuDNA复合物，在DNA附近生产的自由基很容易攻击这个靶目标，因此Cu能引起核DNA单、双链断裂，碱基交联、氧化、置换等。可推测在Cu过载状态下，线粒体内选择性积累的Cu会以易受氧化损伤的mtDNA为靶目标。而分布于胞浆与溶酶体的Fe即便在过载状态下，亦不会积聚到线粒体，故不能诱导上述作用。若Cu清除途径发生障碍，如编码Cu-转运ATP酶的核基因发生突变，就会产生Wilson’s疾病，其特征性体征就是与mtDNA损伤有关的微血管脂肪变性［35,36］。mtDNA参与编码氧化磷酸化（OXPHOS）中13种多肤。由于mtDNA缺少组氨酸保护及有效的修复系统，具有易损伤和高突变的特征。在缺血缺氧有关疾病中的mtDNA发生变化，Corral等［37］对10例正常人、7例冠心病和10名非缺血性心脏病人的心肌组织进行mtDNA 4977缺失的定量分析，发现40岁以下正常人无缺失，40岁以上者有低水平缺失，缺失率为0.0035%,冠心病人缺失率为0.85%，比正常组高82200倍。
魏瑾等［38］采用定量PCR法首次发现心功能正常的VMC患者心肌细胞存在mtDNA 4977和mtDNA 7436缺失，且其缺失程度显著高于正常对照组。DCM患者心肌细胞mtDNA的缺失率又显著高于VMC患者。这一结果高度提示:mtDNA缺失可能是VMC发病以及VMC向DCM演变的重要心肌损伤机制，mtDNA 4977和mtDNA7436是两种最常见的缺失突变类型。其缺失的结果是影响OXPHOS中5种复合酶中4种复合酶蛋白（复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ）的编码，导致OXPHOS异常，细胞ATP合成能力下降，能量代谢发生障碍［39,40］。
3 小结
综上所述，线粒体既是细胞的能量工厂，也是细胞的凋亡控制中心，线粒体会担负起如此重要的双重功能的一个主要的原因是各类生长因子都可以促进葡萄糖转运和己糖激酶等向线粒体转运、加速能量生产，相反地剥夺生长因子后，细胞氧消耗降低、ATP合成不足、蛋白质合成受阻，最后细胞走向死亡。由于这一方面的资料较少，目前还很难做出一个较好的解释，只能留待以后的研究来完善。
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作者单位： 1 250000 山东济南，济南华夏医院
2 100022 北京，北京工业大学生命科学与生物工程学院（2005级研究生）
（编辑：朱兆耘）