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【摘要】 目的 观察同型半胱氨酸对正常妊娠晚期孕妇血小板L-arg/NO系统的影响及意义。方法 选择正常妊娠晚期孕妇12例，采用放射性核素 3 H-L-arg标记法，分别测定正常妊娠晚期孕妇（对照组）及经同型半胱氨酸孵育过（Hcy组）的血小板内L-arg转运、NOS的活性，比色法测定血小板内NO含量。结果 经同型半胱氨酸孵育过的血小板L-arg转运为（3.70±0.72）pmol/108pt·min -1 ，正常妊娠晚期孕妇血小板L-arg转运为（5.82±1.35）pmol/108pt·min -1 （P<0.01）;对照组在Ach刺激前后NOS活性、NO产量均较相应的Hcy组为高（P<0.05或P<0.01）;在Ach刺激后Hcy组NOS活性、NO分别增加了7.03%及31.58%，而对照组分别增加了39.38%及46.15%，较Hcy组明显增多。结论 同型半胱氨酸影响血小板L-arg的转运，使NOS的活性降低，血小板内NO水平降低，同型半胱氨酸损伤血小板L-arg/NOS/NO系统。
关键词 同型半胱氨酸 妊娠晚期 血小板 L-arg转运 NOS活性 NO
Homocysteine on L-arginine/nitric oxide pathway of platelets in third-trimester pregnancy
Wang Jurong，Yan Hua，Wang Zhiwen，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology，Handan Central Hospital，Handan056001.
【Abstract】 Objective To study the mechanism of damage in platelets function caused by homocysteine in third-trimester pregnant women，by observing the changes of the L-arg/NO pathway of platelet.Methods Twelve third-trimester pregnantwomen were enrolled for this study.Half of every plasma sample was incubated byhomocysteine.The velocity of L-arg transport，NOS activity and NO production ofplatelets were measured through the marker 3 H-L-arg.Results The velocity of L-arg transport，NOS activity and NO production in incubated by homocysteine were deˉcreased（P<0.05，P<0.01）compared to the plasma of normal pregnant women，espectively.Conclusion The velocity of L-arg transport，NOS activity and NO production of platelets were decreased in plasma incubated by homocysteine.And such phenomenon could be explained by a derangment of the platelets L-arg/NOS/NO pathway，which is caused by Homocysteine.Key words homocysteine third-trimester pregnancy platelet the velocity of L-arg transport NOS activity NO
血小板内存在左旋精氨酸/一氧化氮（L-arg/NO）通路，血小板合成的NO能抑制血小板黏附和聚集。同型半胱氨酸（Hcy）引起血小板浓度依赖性精氨酸（L-arg）的摄入减少，浓度依赖性亚硝酸盐产物减少。本文研究了Hcy对正常妊娠晚期孕妇血小板L-arg/NOS/NO通路的影响，报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 2003年9月～2003年10月在河北医科大学第二附属医院住院的正常妊娠晚期孕妇12例，所有病例无合并症及并发症，一般情况如年龄、体重、身高、孕龄、新生儿体重、新生儿评分等 无明显差异。
1.2 方法
1.2.1 标本采集与富含血小板血浆（PRP）的制备:清晨、空腹、分娩前、肘静脉采血5ml置于3.8%枸橼酸钠（与血液比例为1∶9）抗凝塑料管中，轻轻摇匀，800rpm离心10min，上清液即为PRP/min。取PRP置于另一离心管中，4000rpm离心1min，除去红细胞，-70℃保存待测。
1.2.2 血小板悬液的的制备 取PRP4000min离心15min，上层为贫血小板血浆（PPP），下层为血小板沉淀。加HEPES缓冲液（in mmol，Hepes3.5，NaCl137，KCl2.7，NaH 2 PO 4 3，MgCl 2 1，pH7.4）于血小板沉淀中，3350rpm离心10min，弃上清液，重复洗涤一次，血小板悬浮于含CaCl 2 和葡萄糖的HEPES缓冲液（in mmol，Hepes3.5，NaCl137，KCl2.7，NaH 2 PO 4 3，MgCl 2 1，CaCl 2 1，glucose5）中，调整血小板数为5×10 8 cells/ml。将上述每位血样分为两组，即对照组与Hcy组。在Hcy组样本中加入0.02mmol/L浓度的Hcy。两组同时在37℃孵育90min后洗涤1次，待用。
1.2.3 血小板L-arg转运测定 取PRP100μI，振荡孵育15min，加入胶原4μg/ml，继续孵育5min，加入L-arg100μmol/L， 3 H-L-arg1μCi，孵育1min，加入终止液（in mmol，formaldehyde270，EGTA16，NaCl150）终止反应，经Millpore过0.45μm微孔滤膜负压抽滤，凉干滤膜后加入5ml闪烁液，暗箱过夜，在β-液体闪烁计数仪上测放射性强度，换算为血小板L-arg转运量（pmol/10 8 pt）。同时测不加样本的非特异平行对照管，L-arg血小板转运为总摄入量与非特异结合之差，pmol/10 8 pt·min -1 表示。
1.2.4 血小板NOS活性测定 分别将对照组与Hcy组分为加乙酰胆碱（Ach）和不加Ach两个亚组，即C 1 组（对照组加Ach）和C 0 组（对照组不加Ach）、H 1 组（Hcy组加Ach）和H 0组（Hcy组不加Ach），即在C 1 和H 1 血样中加入1μmol Ach，30min后分别取各亚组PRP100μl（1×10 7 cells），-70℃冰箱反复冻溶三次使血小板破碎，与100μ孵育液（in mmol，Tris-HCl50，pH7.4，NADPH0.1，CaCl 2 2.0，L-arg0.03， 3 H-L-arg1μCi，钙调蛋白1μg/100μl）于37℃振荡孵育30min，用100μl冷终止液（in mmol，NaAc20，pH5.5，L-胍氨酸1，EDTA2，EGTA0.2）终止反应，30%1.0mlDowex AG50w-x8（Na + ）过柱，4℃静置1小时，4℃12000rpm离心15min，取上清液0.2ml置闪烁瓶中，液闪记数仪记数 3 H-L-胍氨酸（3 H-L-cit），以pmol/10 8 ·min -1 血小板中L-胍氨酸（L-cit）的形成表示NOS活性。
1.2.5 血小板NO水平测定 采用比色法检测血小板中NO 2ˉ 和NO 3ˉ 的含量之和来间接反映血小板中NO水平。按照试剂盒中规定的操作步骤进行操作。
1.2.6 试剂来源 3 H-L-argnine，L-argnine，NADPH为美国Sigma公司产品，余为市售分析纯试剂。
1.3 统计学方法 Casio Scientific Calculation fx-3600P辅助，采用Student t检验，结果以均值±标准差（ˉx±s）表示，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 Hcy组血小板L-arg转运为（3.70±0.72）pmol/10 8 pt·min -1 ，对照组血小板L-arg转运为（5.82±1.35）pmol/10 8 pt·min -1 （P<0.01），Hcy组血 小板L-arg转运较正常妊娠晚期妇女组降低57.29%。
2.2 对照组在Ach刺激前后NOS活性、NO产量均较相应的Hcy组为高（P<0.05或P<0.01）。Hcy组及对照组血小板悬液在Ach刺激后NOS活性、NO产量均增加，Hcy组分别增加了27.03%及31.58%，而对照组分别增加了39.38%及46.15%，较Hcy组明显增多，见表1。表1 血小板NOS活性、NO量的测定 （略）注: # C 0 与H 0 相比P<0.05， ˇ C 1 与H 1 或C 0 与H 0 相比P<0.01。
3 讨论
血小板内存在L-Arg/NO合成通路系统 ［1］ ，血小板L-arg/NO系统包括细胞外L-arg通过高亲和力非Na + 的Y + 蛋白氨基酸载体转运入细胞，再在分子氧和血小板内一氧化氮合酶（NOS）作用下生成NO，激活细胞内鸟苷酸环化酶（GS），环磷酸鸟苷（cGMP）大量增多，通过细胞内cGMP的升高，胞浆内钙离子（Ca 2+ ）;水平降低，来抑制血小板的黏附与聚集功能。研究指出 ［2，3］ 血小板自身的L-arg/NO合成通路在调节血小板聚集中更为重要。特别在内皮功能受损、血小板过度激活时这种意义更大。Neri ［4］ 认为血小板内L-arg在NOS的作用下使L-cit含量升高从而降低血小板聚集。
Facchinetti ［5］ 认为血小板存在L-arg/NO通路，对正常妊娠妇女进行体外L-arg的孵育可以降低血小板的聚集，对妊娠妇女体内L-arg的灌注也能降低血小板聚集。同型半胱氨酸（Hcy）引起血小板浓度依赖性L-arg的摄入减少 ［6，7］ ，浓度依赖性亚硝酸盐产物减少，以及cGMP减少，提示NO释放减少;Hcy可间接抑制体外培养的内皮细胞eNOS的活性 ［8］ ，导致NO生成减少。由于NO生成减少，对血小板黏附聚集功能的负反馈调节功能降低，血小板反应性增加，其黏附聚集功能增强。结果表明，血小板功能异常可能与Hcy使血小板L-Arg/NO途径改变有关。本实验证实同型半胱氨酸（Hcy）引起血小板浓度依赖性L-arg的摄入减少，NOS活性减低，NO生成减少，L-Arg/NO转运系统受损。Hcy是一种含硫氨基酸，代谢途径需要VitB 12 、VitB 6 、四氢叶酸参与。高同型半胱氨酸血症的产生与多种因素有关，其中VitB 12 和叶酸缺乏为其原因之一。大量实验证实，血清叶酸、VitB 12 水平与血浆Hcy呈负相关性。对于高同型半胱氨酸血症患者，适当补充VitB 12 、叶酸及NO合成底物L-Arg，使Hcy水平降低，可能会促进血小板NO生成，有利于血小板功能的改善。妊高征存在高同型半胱氨酸血症（Hhcy） ［9，10］ ，重度妊高征时血小板L-Arg/NO转运系统受损 ［4，5］ ，我们所给同型半胱氨酸孵育浓度与妊高征同型半胱氨酸浓度相似。通过本试验是否可解释妊高征时血小板黏附及聚集功能增强、血小板L-Arg/NO通路的改变与Hcy升高有关，妊娠期补充VitB 12 、叶酸是否可预防妊高征的发生，有待进一步研究。
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作者单位:056001河北省邯郸市中心医院
050000石家庄河北医科大学第二临床医学院
066000河北省秦皇岛市第一人民医院
（收稿日期:2004-06-15）
（编辑海 霞）