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【摘要】 目的 建立获得性多药耐药（MDR）基因表达小鼠模型，探讨临床早期发现化疗耐药、系统检测耐药程度和逆转耐药的方法。 方法 模拟临床联合化疗，给予小鼠腹水型S180细胞反复刺激，诱导MDR表达并定量检测表达量和S180细胞凋亡指标，应用维拉帕米（verapamil，VPL）调节耐药性的逆转。 结果 实验组小鼠自化疗后1周MDR表达逐渐增高，自第5周后显著性增加（P<0.01）;而S180细胞Fas因子表达及凋亡率则随化疗时间的延长而逐渐下降，MDR表达显著性增加时，S180细胞凋亡率等则显著性降低（P<0.05）。 结论 本方法建立的S180细胞多药耐药小鼠模型有助于获得在体研究MDR表达的经验，应用VPL能调节耐药性的逆转。
关键词 动物模型 多药耐药基因 细胞凋亡 化疗 调节剂
The study of obtained MDR gene expression of mouse-ascites S180cell line and adjusting of chemotherapy resistance
Zhu Tongyu，Yin Geping，Chen Ming，et al.
Department of Gynecology and Obstetrics，Jinan Military Command General Hospital，Jinan250031.
【Abstract】 Objective To establish the mouse-ascites S180-line model with obtained multidrug resistant（MDR）gene xpression in order to discover the clinical method for indicating and systematic examining the chemotherapy esistance.Methods The mouse ascites S180cells were repeatedly stimulated by imitating clinically combined cheotherapy to induce the MDR xpression.Then the cellular P 170 contents and apoptotic parameters of the S180cells were assayed.Verapamil（VPL）was used to adjust the obtained chemotherapy-resistance.Results The P 170 contents of mouse in test group began to increase since the irstweek，and increased significantly after the fifth week（P<0.05）.At the same time the apoptotic rates and Fas factor xpression contents gradually decreased.The apoptotic rates and Fas fac-tor expression contents of S180cells with obtained hemotherapy-resistance became increasing after the use of VPL，while the P 170 content kept permanent.Conclusion The stablishment of obtained MDR expression mouse ascites-S180line model is helpful to study the obtained resistance of hemotherapy in human body.The study also suggests that VPL could adjust this kind of obtained chemotherapy-resistance.
Key words animal model multidrug resistance cellular apoptosis chemotherapy adjustor
恶性肿瘤在化疗过程中逐渐产生耐药性是当今肿瘤治疗中的一大难题 ［1～6］ 。以往的人体外癌细胞化疗耐药研究多采用细胞系研究的方法 ［1～3］ ，但在体内化疗过程中恶性肿瘤细胞的消亡是机体免疫系统及化疗药物等相互作用的结果，故应用恶性肿瘤细胞系体外化疗的耐药性研究从某种程度上难以模拟恶性细胞在人体内受到化疗作用时的状态。小鼠肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因的结构和功能与人类肿瘤有相关性 ［3］ 。本研究的目的是应用目前临床治疗恶性肿瘤较常用有效的化疗方案，反复刺激S180细胞（腹水型肉瘤细胞系）接种小鼠，建立获得性MDR基因表达小鼠模型，以获得在体研究MDR的经验，并探讨应用钙离子拮抗剂维拉帕米（VPL）对增加耐药小鼠S180细胞凋亡程度的作用，为临床早期发现化疗耐药和逆转耐药提供可行的检测方法。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 动物肿瘤细胞接种和实验分组 S180细胞小鼠为腹水型传代瘤种，购自山东省医学科学院药物研究所。制取瘤种小鼠腹水2ml，以1ml生理盐水稀释，取其0.5ml注入无瘤小鼠腹腔内，计质量。昆明种小鼠，质量19～21g，共100只，雌雄各半，由山东省实验动物中心提供，随机分为5组。实验组（接种后给药）分4组:单纯化疗组20只（A组）;化疗药量加倍组20只（B组）;常规化疗加用VPL组20只（C组）;化疗药量加倍再加用VPL组20只（D组）。对照组（E组）20只（仅接种S180细胞，未用化疗药物治疗）。每周制取腹水检测化疗药物对S180细胞MDR表达及凋亡情况和小鼠体重增长、存活时间。1.1.2 检测试剂 PI（碘化丙啶）及FITC（异硫氰酸荧光素）标记的鼠抗鼠单克隆抗体分子探针:Fas因子（细胞凋亡因子CD95/Apo-1）、MDR表达产物P 170 （P-糖蛋白、P-gp）均为美国Pharmigen的产品，购自深圳晶美生物公司;EB（藻红蛋白）标记P 170 抗体购自美国贝克曼库尔特生物公司。
1.2 方法
1.2.1 化疗药物和方案 采用目前临床常用的PFC联合化疗方案:（1）国产顺铂（cisplatin，Pt），3×10 -3 mg/（g·d），加入1.0ml生理盐水，每周注射1次;（2）国产环磷酰胺（cytoxan，CTX），6×10 -3 mg/（g·d），拌入饲料中，每日1次共7d，每3周重复1次:（3）国产5-氟尿嘧啶（5-FU），6×10 -3 mg/（g·d），用法同环磷酰胺。VPL（国产），方法:3×10 -3 mg/（g·d），加入1.0ml饮用水，化疗期间应用。
1.2.2 S180细胞MDR表达及凋亡的检测 取上述S180细胞稀释液少许涂片，加10μl P 170 单克隆抗体，20min后在荧光显微镜下观察瘤细胞MDR表达情况并拍照，其余腹水分装入4支试管调整细胞数在10 6 个/ml，分别加入PI及相应的P 170 、CD95荧光单克隆抗体分子探针工作液进行免疫标记20min ［4］ 。以生理盐水1.0ml漂洗、离心（1500r/min、10min）后，除去上清液，加入生理盐水500μl后进行流式细胞仪检测（FACScan型，美国BD公司生产），上机后收取2万个细胞，计算机记录荧光散射数据、荧光强度后分别以CellQuest Plot软件（BD公司生产）分析CD95和MDR表达量，Modifit LT软件（BD公司生产）分析凋亡率 ［5］ 。S180细胞MDR/CD95分子表达量（%）=各种分子阳性表达的细胞数/受检细胞数×100%
1.2.3 S180细胞小鼠体重增长、存活时间 分别于接种之日起每7d计数实验组及对照组质量，逐日记录各组小鼠存活时间（d）。
1.3 统计学方法 采用未配对资料的t检验方法。数据采用“均数±标准差”表示。
2 结果
2.1 腹水S180细胞MDR、CD95表达和凋亡率变化 小鼠第1～7周腹水S180细胞MDR、CD95表达和凋亡率，见表1。
表1 腹水S180细胞MDR、CD95表达和凋亡率变化 （略）注:与本组第1周比较 * P<0.05，差异有显著性， ** P<0.01，差异有非常显著性;与同期A组比较， △ P<0.05，差异有显著性， △△ P<0.01，差异有非常显著性 2.1.1 对照组（E组） 小鼠于3周后全部死亡。上述各指标在第1、2、3周均无显著变化（P>0.05），与实验各同期比较，除MDR第1周差异无显著性（P>0.05），其余均处于较低水平，差异存在显著性（P<0.05）。
2.1.2 实验组（A、B、C、D组） MDR的表达随化疗时间的延续，各组均逐步上升，且在第5周后均显著高于同组第1周（P<0.05，<0.01）;B组与A组、D组与C组同期比较MDR表达虽总体上略高，但差异无显著性（P>0.05）。CD95表达各组于第1周差异无显著性（P>0.05），A、B两组呈降低趋势，与同组第1周比较，A组第6周开始表现为显著降低（P<0.05），B组第7周也表现为显著降低（P<0.05）;相反，C、D组却呈逐周升高趋势，分别于第5周和第4周开始呈现显著性升高（P<0.05，P<0.01），且第3周开始皆显著高于A组同期CD95的表达（P<0.05，P<0.01）。凋亡率第1周各组差异也无显著性（P>0.05），但A、B组呈逐渐降低，第3周后与同组第1周比较出现显著性降低（P<0.05），而两组间同期比较差异无显著性（P>0.05）;C、D两组始终保持在各自的第1周水平（P>0.05），两组间同期比较差异无显著性（P>0.05），但第3周开始都显著高于A组同期（P<0.05，P<0.01）。
2.2 小鼠腹水增长与体重及生存期变化 小鼠体重增长及生存期变化见表2。对照组小鼠20只，第1周体重增长（0.9±0.1）g，第2周增长（2.7±1.0）g。对照组小鼠自第1周后腹水快速增长，呈现消瘦、少动、皮毛枯燥，自第2周起陆续死亡，第3周末时全部死亡;实验各组:A组中有4只无明显腹水增长，其余自第10天后明显增长，第3周时体重增长（2.1±0.7）g，3只于第28～31天内死亡（15.0%），3只小鼠保持少量腹水;B组生存期较A组稍延长，但差异无显著性（P>0.05）;C组生存期较A组显著延长（P<0.01）;D组生存期也较A组显著延长（P<0.05）。提示C组生存期最长。
表2 实验小鼠的体重增长及生存期 （略）注:与E组比较， * P<0.05，差异有显著性， ** P<0.01，差异有非常显著性;与A组比较， △ P<0.05，差异有显著性， △△ P<0.01，差异有非常显著性
3 讨论
目前认为在长期化疗药物作用下，癌细胞MDR逐渐表达而产生了耐药性（获得性耐药性）。多药耐药性的肿瘤细胞有一个明显的生化特征是MDR过度表达P 170 糖蛋白。P l70 位于细胞膜上，在钙离子的参与下加快多种化疗药物从细胞内的排泄，使癌细胞凋亡率及Fas因子表达率水平逐渐下降 ［7］ 。在外周血P 170 也可出现在自然杀伤细胞（NK）、细胞毒抑制T细胞（CD8）、B淋巴细胞及少数辅助诱导T细胞（CD4）等细胞膜上，在药物的长期作用下上述细胞MDR可增加P 170 的表达 ［5］ 。
细胞凋亡是细胞程序性死亡，与肿瘤细胞的生长、发展密切相关，是研究抗癌药物对肿瘤治疗敏感性非常重要的一个指标 ［8］ 。研究证实多种细胞毒性抗癌药物如顺铂等可诱导细胞凋亡。细胞凋亡可因Fas因子（CD95或Apo-1）的作用启动，它为分子量48kD的膜糖蛋白，属肿瘤坏死因子（TNF）家族 ［9］ 。VPL主要通过阻滞钙离子通道，使P 170 功能减退或失活，从而提高癌细胞内抗癌药物浓度和滞留时间，减弱了癌细胞对化疗药物的抵抗性，增加了化疗疗效。
本研究显示，腹水型S180瘤细胞接种小鼠在单纯化疗、单纯化疗药物剂量加倍和两种化疗下分别应用VPL等4种条件下，S180细胞MDR表达均呈现显著增高趋势（P<0.05，P<0.01），且组间差异无显著性，提示在化疗药物影响下，无论是否增加药物剂量、是否加用逆转耐药的调节剂，S180细胞小鼠均产生耐药性，简言之，VPL没有阻止MDR基因表达的产生和增强。单纯化疗的两组小鼠S180细胞CD95的表达和凋亡率由最初与对照组小鼠比较的显著增高（P<0.05）到增幅显著减小，提示单纯化疗药物刺激下，即使适当增大药物剂量，最初的药物毒性杀瘤效果都会逐渐降低。这与耐药性产生并增强的实验结果相吻合。而加用VPL的两组小鼠S180细胞的CD95表达却表现为显著的逐步升高趋势（P<0.05，P<0.01），同时凋亡率始终保持最初的显著增高水平（P<0.05，P<0.01），显示化疗药物一直发挥着明显的杀瘤作用。而且，从生存期和一些实验观察来看，加用VPL的两组小鼠生存期显著性延长（P<0.05，P<0.01），与这两组小鼠S180细胞保持着高水平的凋亡率相符合。因此，上述情况理应与耐药性调节剂VPL的应用有关。提示在所建立的耐药小鼠动物模型中，钙离子拮抗剂VPL对耐药起到了降调节作用，即调变耐药性或逆转耐药性。其机制可能与逆转耐药的部分机制一致。另外，给予调节的耐药小鼠CD95表达变化与凋亡率呈现非同步性的原因可能与多途径的凋亡机制有关，即CD95表达并非细胞凋亡的惟一相关因素，因此并不能全面反映细胞系的凋亡状况，但具体机制尚不清楚。
本研究结果提示，对于获得性耐药S180小鼠，常规化疗加用VPL的疗效明显好于单纯增加化疗药物剂量。虽然VPL没有阻止MDR基因表达的产生和增强，但明显促进CD95的表达并维持了较高的凋亡率，起到了调节或逆转耐药性的作用。
参考文献
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（编辑建 伟）
作者单位:250031山东济南军区总医院妇产科