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肿瘤的多药耐药（multidrug resistance, MDR）是指肿瘤对多种化学结构不同、作用靶标各异的化疗药物的抗性。这些药物的共同点在于均为具有复杂有机环状机构的大分子天然产物或天然产物的人工半合成品。MDR是构成肿瘤化疗成功最为严重的障碍之一。从基础到临床，近20年来，为克服之而进行的持续努力，虽在一定程度上揭示了其产生的可能机制，并探索了潜在的克服途径如采用逆转剂进行逆转等，但迄今为止，仍未发现一种临床真正有效的药物或疗法能够使患者较顺利地度过因MDR而产生的治疗危机［1，2］。
MDR逆转剂等难于克服临床耐药，因而研发对MDR机制不敏感的新型抗肿瘤药物已日益受到重视，并已有药物取得了一定程度的成功，如伊达比星（idarubicin）等［3，4］。沙尔威辛（salvicine, SAL）是中国科学院上海药物研究所经10余年研究从红根草中提取、分离并经化学修饰获得的全新结构二萜醌类化合物［5］；其在体内外对多种肿瘤尤其是实体瘤具有良好的抗肿瘤活性［6，7］；其抗肿瘤机制主要与抑制拓扑异构酶Ⅱ相关［8］。本文进一步研究沙尔威辛的抗MDR和对MDR细胞K562/A02的凋亡诱导作用，并初步探讨其相关的分子作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品 SAL由中国科学院上海药物研究所植化室张金生教授提供；阿霉素（doxorubicin,DOX）、长春新碱（vincristine, VCR）和鬼臼乙叉甙（etoposide, VP16）分别购自浙江海门制药厂、上海华联制药厂和上海医药工业研究院浦东制药厂。SAL用含50％二甲基亚砜（DMSO）的生理盐水配置成0.1mol/L的储备液，DOX、VCR和VP16分别用生理盐水配置成10mmol/L的储备液，均保存于-20℃；临用前以完全培养基稀释至所需浓度。
1.2 细胞培养 人慢性粒细胞性白血病K562、乳腺癌MCF-7和鳞状上皮细胞癌KB细胞来自美国细胞库（the American Type Culture Collection, ATCC）；其相应的MDR细胞-DOX耐药株K562/A02和MCF-7/ADM细胞购自中国医学科学院天津血液病学研究所，VCR耐药株KB/VCR细胞从中山医科大学引进。上述细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基培养。MDR细胞则维持于含适当浓度诱建药物的培养基中，用于实验前至少在无药培养基中培养1周以上。
1.3 细胞毒性测定［9，10］ 将适当浓度对数生长期细胞的悬液种至96孔微培养板，每孔100μl，受试药物每一剂量设三复孔。加药后于37℃培养72h，采用四氮唑盐还原法（MTT法）进行检测。根据所得光密度计算药物的50％生长抑制浓度IC50值，并求耐药因子（resistance factor, RF）＝IC50MDR细胞/IC50亲本细胞。
1.4 荧光显微镜术［11］ 以不同浓度的SAL作用于K562和K562/A02细胞24h，收集细胞，PBS洗1次，用3％多聚甲醛（pH7.4 PBS）室温固定30min，PBS洗涤后加入1％ Tritox-100，作用4min，再用DNA荧光染料二氨基苯基吲哚（DAPI，0.5μg/ml, pH7.4）避光染色60min，荧光显微镜观察细胞形态并拍照。
1.5 琼脂糖凝胶电泳［11］ 按1.4方法处理并收集细胞，经细胞裂解，提取DNA，于1.5％琼脂糖凝胶电泳，采用紫外凝胶成像系统（UVP，GDS8000）观察并拍照。
1.6 流式细胞术［11］ 按方法1.4处理并收集细胞，PBS洗涤，70％乙醇4℃固定12h；再用PBS洗涤1次后用含50μg/ml RNA酶、0.5％ Triton X-100和0.1％柠檬酸三钠的碘化丙啶（PI，50μg/ml）避光染色30min，流式细胞仪（Becton-Dickinson Co.）检测细胞的凋亡率。
1.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法 不同浓度SAL处理K562/A02及其亲本细胞24h后，提取总RNA，逆转录，将产物cDNA进行PCR后进行电泳测定。PCR所用引物见表1。
各基因的mRNA相对表达量（relative gene expression for mdr-l, MRP,LRP，p53，Bcl-2, or bax genes, RGE）按以下等式计算：RGE=(GIS/GGIS)/(GIP/GGIP)×100％，其中GIS代表样品的mdr-l，MRP，LRP，p53，Bcl-2，或bax基因量；GIP代表阳性对照的mdr-l，MRP，LRP，p53，Bcl-2，或bax基因量；GGIS代表样品的GAPDH基因量；GGIP代表阳性对照的GAPDH基因量。
表1 mdr-l，MRP，LRP，p53，Bcl-2，bax基因的PCR引物序列（略）
1.8 Western Blot法 收集不同浓度SAL处理24h的K562/A02细胞，提取总蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳，将蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，与P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）特异性抗体JSB-1（Sigma公司产品）作用、洗脱，显色后照相。
2 结果
2.1 SAL的抗MDR作用 采用MTT法测试SAL对人红白血病细胞K562/A02、乳腺癌细胞MCF-7/ADM和鳞癌细胞KB/VCR 3 株MDR细胞及相应的亲本K562、MCF-7和KB细胞株的体外增殖生长抑制作用，实验至少重复3次。表2～4显示SAL对3株MDR细胞株呈现强效抗MDR作用：IC50分别为1.55μmol/L（K562/A02）、1.40μmol/L（MCF-7/ADM）和4.50μmol/L（KB/VCR）；其平均值为2.48μmol/L，作用远强于对照药DOX、VCR（344.35）、DOX（233.19）和VP16（71.22）；其抗耐药活性分别是VCR、DOX和VP16的242.50、164.22和50.15倍。此外，表3还显示SAL对MDR细胞MCF-7/ADM的细胞毒性作用明显强于其亲本，IC50值分别为1.40和2.61μmol/L；但对K562/A02和KB/VCR细胞作用则较相应亲本略弱。
表2 SAL对K562和K562/A02细胞的生长抑制作用和抗耐药作用（略）
表3 SAL对MCF-7和MCF-7/ADM细胞的生长抑制作用和抗耐药作用（略）
表4 SAL对KB和KB/VCR细胞的生长抑制作用和抗耐药作用（略）
2.2 SAL诱导K562/A02细胞凋亡 通过DAPI染色，采用荧光显微镜术、流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳等检测SAL对K562/A02细胞及其亲本的凋亡诱导作用。结果表明，SAL对K562/A02细胞及其亲本具有同等强度的凋亡诱导作用，不同浓度的SAL（2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、12μmol/L）作用于K562和K562/A02细胞24h后，荧光显微镜可见明显的凋亡形态学特征：细胞核明显缩小甚至核固缩，程度不等的凋亡小体。流式细胞术显示4μmol/L以下浓度的SAL作用24h，两株细胞的凋亡改变不明显；8μmol/L时，凋亡细胞量明显增加至40.50％（K562细胞）和69.48％（K562/A02细胞）；当浓度为10μmol/L时，凋亡细胞百分率达到75.64％（K562细胞）和59.10％（K562/A02细胞），并见明显的凋亡峰。而DOX诱导耐药株K562/A02细胞凋亡的能力明显较诱导敏感株K562细胞凋亡的能力弱。DNA电泳也呈现典型的梯形条带。当SAL浓度为2μmol/L时，K562和K562/A02细胞DNA电泳图谱既即有梯状条带出现；当SAL浓度为4μmol/L和8μmol/L时，电泳显示出K562和K562/A02细胞的DNA梯状条带愈趋明显。
2.3 SAL降低mdr-l mRNA和P－糖蛋白（P-gp）的表达 RT-PCR结果显示mdr-1基因在敏感株K562细胞中没有表达，在耐药株K562/A02细胞中高表达。当1μmol/L SAL作用24h后，mdr-1基因的mRNA表达量即出现下降，为对照组的87.35％；SAL浓度为2μmol/L时，mdr-1 mRNA的表达降至对照组的35.59％，以后随着SAL浓度增加，其表达继续下降，呈现良好的量效关系，当SAL浓度为8μmol/L时，mdr-1 mRNA表达量不到对照组的1％；16μmol/L时条带完全消失。
与此相一致，Western blot法也显示SAL能明显减少mdr-1基因产物P-gp蛋白的表达量。不同浓度的SAL（2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L）对K562/A02细胞作用24h后明显下调P-gp蛋白的表达。当SAL浓度为2μmol/L时，P-gp表达量即下降至70.27％，以后随着浓度的升高，P-gp表达量进行性下降；在8μmol/L浓度时，P-gp表达量仅为对照组的18.84％。此外，不同浓度的SAL（2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）作用于MDR细胞K562/A02 24h后，并设未加药处理的K562为对照，RT-PCR结果显示在敏感株K-562细胞中MRP基因没有表达，对照组K562/A02中MRP基因高表达。随着SAL浓度的增加直至8μmol/L，MRP基因在K562/A02细胞中的表达量无明显变化。而LRP基因在敏感株K562细胞和耐药株K562/A02细胞中均未见表达。
2.4 SAL对凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA表达的影响 RT-PCR法显示SAL能明显下调Bcl-2 mRNA的表达，升高Bax/Bcl-2 的比例。MDR细胞K562/A02的Bax在对照组中高表达。不同浓度的SAL（分别为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）作用24h后，Bax基因的表达略有下降。Bcl-2在K562/A02中的表达较Bax低，在不同浓度的SAL作用24h后，表达下降明显，在SAL浓度为8μmol/L时表达基本消失。虽然SAL对Bax和Bcl-2皆有下调作用，但是Bax/Bcl-2比例是上调的。当SAL浓度为2μmol/L时，Bax/Bcl-2为1.03；当浓度为8μmol/L时，Bax/Bcl-2比例上升到1.39。p53在K562/A02中表达也较低，但是在SAL作用后没有明显的变化。
3 讨论
肿瘤产生MDR时，对MDR类抗癌药物的敏感性剧烈减低，作为药物外排泵的Pgp过度表达是可能机制之一；此外，尚可能于MRP、LRP或（和）谷胱甘肽S-转移酶过度表达及分子作用靶标如拓扑异构酶的活性或结构改变相关。几乎所有抗癌药物均经诱导凋亡发挥其作用，且耐药肿瘤也同时耐凋亡。已发现凋亡相关基因与肿瘤的药物敏感性密切相关［12］，且已阐明Pgp可保护MDR肿瘤细胞免遭多种形式的caspase依赖性凋亡［13.14］。迄今，有关MDR的产生机制已积累了丰富的资料，而目前正在试验中的MDR逆转剂临床疗效不甚理想，毒副作用较大。因此，除了继续努力寻找新结构或新作用机制的MDR逆转剂外，那些对MDR机制不敏感、可诱导MDR肿瘤凋亡的新抗肿瘤药物也越来越受到关注。
已发现一些抗耐药作用较好的化合物，如法国施维亚公司［15］研究的吡啶卡巴唑衍生物S16020-2，对7株MDR细胞的RF平均值为7.7；伊达比星［3.4］也具有抗耐药作用，其对骨髓瘤MDR细胞的平均RF为2.2；Takara等［16］研究的spicamycin衍生物KRN5500，对MDR细胞LLC-GA5-COL150的RF为1.1；以及Martina等［17］发现的dehydrothyrsiferol，其对MDR细胞KB-8-5的RF为0.39。在这些化合物中，KRN5500和dehydrothyrsiferol的抗耐药作用较好，但只是对单株耐药细胞的作用。总的来说，抗耐药作用好的化合物报道仍较少。
本文采用MTT法测试SAL对3株MDR细胞K562/A02、MCF-7/ADM和KB/VCR的体外增殖生长抑制作用，探讨SAL的抗MDR作用。结果显示，SAL在体外对敏感细胞（包括白血病和实体瘤）的增殖生长具有明显的抑制作用，这与笔者先前取得的结果一致［8］。SAL对耐药细胞的增殖生长也同样具有明显的抑制作用，其IC50分别为1.55μmol/L（K562/A02）、1.40μmol/L（MCF-7/ADM）和4.50μmol/L（KB/VCR）。与阳性对照药相比，SAL显示了良好的抗耐药作用，对3株MDR细胞的平均RF为1.42，远小于其他几个常用抗癌药物的RF。本实验中选用的3株MDR细胞的来源各不相同，诱建的药物分别为VCR和DOX，而且SAL对乳腺癌MCF-7/ADM的细胞毒性作用强于对其亲本的作用，这提示SAL的强效抗耐药作用具有一定的普遍意义。SAL对耐药性肿瘤具有广泛显著的抗耐药效应显示了其良好的应用前景，对此，还将在体内试验中进一步验证。
已知MDR类药物如蒽环类、长春碱类、鬼臼毒素类和紫杉醇类等，其结构和来源上的共同点是均为具有复杂有机环状结构的大分子天然产物或天然产物的人工半合成品；SAL为来源于植物先导结构的人工修饰品，同样具有复杂的有机环状机构，而且具有抗MDR作用。这至少提示与传统MDR类药物结构和来源相似的化合物，亦可能对MDR机制不敏感，可能并可以发展成为新型的、具有抗MDR作用的抗肿瘤药物。
在MDR机制中，目前被广泛接受的解释是减少细胞毒性药物在细胞内的积累和改变这些药物在亚细胞水平的分布。在许多情况下，这种现象是由位于细胞膜的P-gp或MRP能量依赖性地对细胞毒性药物外排所导致的。正是由于这种外排作用使得多种抗肿瘤药物难以到达其作用靶点或在细胞内的药物浓度难以达到其有效作用浓度，从而形成MDR。在MDR细胞中，抑制P-gp或MRP的功能或降低其表达能够逆转其对抗癌药物的耐受［1］。P-gp和MRP同属ABC转运子家族，二者基因系列高度同源，都能介导药物外排，但是MRP的外排作用需要谷氨酰胺［1］。通常，P-gp也存在于正常组织中，如肾、肝、胰腺和小肠的上皮细胞，以及大脑和睾丸的毛细管内皮中。在这些细胞中，P-gp的功能与其在MDR细胞中的功能相同，持续地将有毒物质排出细胞或防止有毒物质通过血脑屏障和血睾屏障［1］。LRP是1993年发现的又一能介导MDR现象的蛋白质。与MDR和MRP不同，LRP是位于细胞质核周区的110kSa蛋白质。它也在一些正常细胞中表达，如上皮细胞。目前对其作用机制尚不很清楚，可能与LRP能将细胞毒性药物从细胞核转运至细胞质有关。临床试验表明，其与卵巢癌核急性白血病的内源性MDR现象有关［1］。
本文运用RT-PCR方法探讨了SAL对MDR相关基因mdr-1、MRP和LRP表达的影响。结果显示，K562/A02细胞中mdr-1和MRP的高表达，P-gp也高表达，但LRP未见表达，说明K562/A02细胞的MDR现象可能主要是由mdr-1和MPR的高度表达所介导，与LRP无关。K562/A02在建株时其mdr-1基因和P-gp高表达［18］，上述结果与此相吻合。SAL对K562/A02细胞的mdr-1基因的mRNA转录呈现剂量依赖性下调作用，而对MRP的转录没有影响。运用Western blot方法进一步分析SAL对mdr-1基因表达产物P-gp的影响，发现SAL对P-gp的作用也呈剂量依赖性下调。这表明SAL的抗耐药作用与降低mdr-1基因的表达，导致Pgp的表达下降有关。此外，本文还观察到SAL对mdr-1 mRNA的表达下调作用和对Pgp表达下调作用呈现非线形相关，当SAL浓度为2μmol/L时，mdr-1 mRNA表达为35.59％，而P-gp的表达量高达70.27％；浓度为8μmol/L时，mdr-1 mRNA表达仅为0.93％，而P-gp的表达还有18.84％。这提示当SAL作用于K562/A02细胞后，导致mdr-1 mRNA表达下降的同时，核糖体合成P-gp可能存在代偿性升高，或者是SAL对P-gp的翻译阶段没有影响。
采用荧光显微镜术、流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳从细胞形态学、凋亡峰与凋亡率和DNA片段化三个方面证实，SAL可明显诱导MDR细胞K562/A02凋亡，且其诱凋亡能力与对亲本K562细胞者相当。而K562/A02细胞能明显抵抗DOX诱导的凋亡，这为SAL的抗MDR作用进一步提供了有力支持。研究SAL对凋亡相关基因的影响，结果发现，在K562/A02细胞中，p53表达水平较低，SAL对p53基因的转录几乎没有影响；Bax表达水平高，SAL对Bax基因的转录轻微下调；Bcl-2有一定的表达，SAL对其的作用是明显下调。运用紫外凝胶成像系统分析结果，发现Bax/Bcl-2随着SAL浓度的增高而比值增大。当SAL浓度为4μmol/L时，Bax/Bcl-2比值为1.25，K562/A02细胞凋亡率9.10％；SAL浓度为8μmol/L时，Bax/Bcl-2比值上升为1.39，K562/A02细胞凋亡率59.10％。一般认为，Bax/Bcl-2的比值决定了细胞凋亡的发生，比值升高，促进凋亡；比值下降，抑制凋亡［13］。这提示SAL诱导K562/A02细胞凋亡与下调Bcl-2表达、升高Bax/Bcl-2比值相关。
以上研究表明，SAL使K562/A02细胞的mdr-1 mRNA和P-gp的表达显著下降，并明显下调Bcl-2 mRNA的表达，升高Bax/Bcl-2的比例，且P-gp和Bcl-2 mRNA表达下调呈平行关系，但对MRP和LRP基因的表达没有影响。这提示SAL抗MDR和诱导MDR细胞K562/A02凋亡的作用机制可能与其降低mdr-1和Bcl-2基因表达、升高Bax/Bcl-2的比例相关。但是，SAL如何引起mdr-1基因和P-gp表达下调、P-gp表达下调是否直接影响以及怎样影响Bcl-2或Bax的表达尚需进一步探讨。此外，MDR细胞MCF-7/ADM较其亲本MCF-7细胞对SAL更为敏感，而K562/A02和KB/VCR对SAL的敏感性则低于相应亲本，强烈提示上述机制可能仅为其抗MDR机制的一部分。因此，SAL抗MDR乃至抗肿瘤的详尽机制仍待深入研究。
本文首次报道了全新结构的二萜醌类化合物SAL的抗MDR作用和对K562/A02 MDR细胞株的凋亡诱导作用。SAL已完成全部临床前研究，目前正在申请进入临床试验；这一作用的发现，不仅为SAL即将进行的临床试验拓展了抗瘤谱，而且也为临床最终克服肿瘤MDR提供了一种可能。
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(编辑：邓 锋)
作者单位： 200031 上海，中国科学院上海药物研究所肿瘤药理实验室