砷剂联合化疗药物治疗MDR人肝癌细胞初步研究

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　［摘要］  目的  通过实验观察砷剂联合化疗药物对人肝癌MDR细胞的治疗和逆转作用，为临床改善肝癌疗效提供理论依据。方法  按砷剂单用或联合化疗药物作用人肝癌细胞QGY-7703/cDDP和HepG2/ADM进行分组，采用光镜和电镜观察细胞形态结构及超微结构的改变，台盼蓝染色活细胞计数测定细胞增殖能力，MTT检测细胞毒作用，FCM进行细胞周期分布分析。结果  肿瘤细胞药物作用后，电镜观察到细胞凋亡和凋亡小体，肿瘤细胞倍增时间延长，生长曲线下移，细胞毒作用明显，G0/G1期细胞比例下降，G2/M期细胞比例增加。结论  砷剂单用和联合化疗对MDR肝癌细胞生长具有抑制作用，同时能够部分逆转人肝癌细胞MDR。

    ［关键词］  砷剂；肝癌；联合治疗；逆转多药耐药

       Study on combination of arsenic trioxide and chemical therapy in treatment of MDR of human hepatocellular carcinoma

    JIANG Ming-dong,XIANG Ting-xiu,PENG Zhi-ping,et al.Department of Nuclear Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

    ［Abstract］  Objective  To study combination of arsenic trioxide and chemical therapy in treatment of MDR of human hepatocellular carcinoma.Methods  The human hepatocellular carcinoma HepG2/ADM and QGY-7703/cDDP were made into every grades by single and combined arsenic trioxide. HepG2 and QGY-7703 were control grades. Morphologic studies were performed with optical microscopy and transmission electron microscopy after the human hepatocellular carcinoma cells were exposed to various drugs. Cell viability was evaluated by the trypan blue exclusion test. Killing effects and proliferative activities were assessed by MTT assay. Cell cycle analysis was performed by flow cytometry (FCM).Results  Apoptotic cell and apoptotic body were observed by transmission electron microscopy in carcinoma cells were exposed to various drugs. At one time, compared to control group, the tumor doubling time were significantly extended, and tumor growth curves were significantly removed down,cell killing effects were significant,cell cycle analysis showed cellular inverse proportions of G0/G1 fall and G2/M elevated.Conclusion  The single and combined arsenic trioxide could restrain the growth of the human hepatocellular carcinoma of MDR, furthermore reverse partially the MDR.

    ［Key words］  arsenic trioxide；hepatocellular carcinoma；treatment in combination；reversion of multidrug resistance

    肝癌是高发的恶性肿瘤，且死亡率高，目前缺乏非常有效的治疗手段。临床诊断的病人多为中晚期肝癌，以化学药物治疗为主，而肿瘤细胞的多药耐药（multidrug resistance,MDR）严重阻碍药物化疗效果。因此，肝癌有效治疗及细胞MDR逆转成为近年肿瘤研究的热点。砷剂(arsenic trioxide,AsT)治疗血液系肿瘤取得突破，对实体瘤也有一定效果。

    为此，笔者利用已建立的人肝癌MDR细胞系QGY-7703/cDDP和HepG2/ADM，观察AsT联合化疗药物对MDR人肝癌细胞生长的影响，探讨MDR肝癌新的有效治疗和逆转方法，以利于改善临床肝癌治疗效果。

    1  材料与方法

    1.1  药物和试剂  亚砷酸注射液（哈尔滨伊达药业公司），ADM（法玛西亚公司），cDDP（海正药业股份公司），MTT、Trypan blue和DMSO（美国Sigma公司），RPMI1640培养液（GIBCO，USA），小牛血清(calf bovine serum,CBS)（杭州四季青生物制剂公司），0.25%胰蛋白酶(华美上海分公司)。

    1.2  肿瘤细胞培养  人肝癌细胞QGY-7703、QGY-7703/cDDP和HepG2由重庆医科大学病理生理教研室汤为学教授惠赠。HepG2/ADM细胞株采用ADM浓度梯度递增法加量诱导建立。细胞培养：常规将肿瘤细胞接种到含10%热灭活小牛血清，并加入青霉素（100 u/ml）和链霉素（100 μg/ml）双抗的RPMI 1640培养液中，37 ℃，5%CO2饱和湿度孵箱内培养，细胞呈单层贴壁生长。传代时用0.1%胰酶和0.02%EDTA溶液消化并离心，培养液稀释后再分瓶培养。QGY-7703/cDDP中0.1 μg/ml cDDP浓度、HepG2/ADM中0.1 μg/ml ADM浓度维持细胞MDR特性。

    1.3  实验分组  依QGY-7703、QGY-7703/cDDP、HepG2和HepG2/ADM细胞株分成4个实验组，另设不加药对照组。取对数期细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×105/ml,接种至96孔培养板，每孔200 μl(相当于105个细胞),培养24 h后加入实验药物，再共培养24 h进行测定。药物分组为：AsT、ADM、cDDP、AsT+ADM和AsT+cDDP，参照各药临床用量的血峰浓度设定试验药物浓度。1.4  细胞形态结构

    1.4.1  HE-光镜观察  5×104/ml单细胞悬液接种至内铺小玻片24孔培养板中，放到37 ℃、5% CO2孵箱内培养72 h，用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min取出晾干，常规苏木素-伊红染色10 min，PBS再洗2遍，室温晾干，中性树胶封片，光镜下观察拍照。

    1.4.2  透射电镜超微结构观察  胰酶消化细胞，PBS洗涤2次，1200 rpm离心5 min，弃上清液，收集1×106个细胞，2.5%戊二醛预固定，继用2%锇酸固定，经梯度酒精脱水后用EPON812包埋，制作超薄切片（600A），染色按常规处理，经醋酸钠和柠檬酸铝双染后，透射电镜超微结构观察拍照。

    1.5  细胞生长曲线和倍增时间测定  取对数生长期细胞，胰酶消化，离心，制成细胞悬液，调整细胞数浓度为5×104/ml，取2 ml细胞悬液接种至15 ml培养瓶内，共21瓶，置于孵箱内培养。自第一天开始用台盼蓝拒染法，以血细胞计数板进行活细胞计数，每日取3瓶细胞，计算均值，连续观察7天。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，并按Patterson公式计算倍增时间（TD）：TD=T×㏒2/（㏒NT-㏒N0）。

    1.6  四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测药物细胞毒作用  取对数期细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/ml,接种至96孔培养板，每孔200 μl细胞悬液,培养24 h后参照各药临床用量的血峰浓度，加入各试验药物20 μl，每个浓度重复3孔，设试剂对照和细胞对照，置37 ℃、5% CO2孵箱内培养72 h。去掉上清液，每孔加无血清培养液200 μl和5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h后离心10 min，吸净孔内液体，每孔加150 μl DMSO，振荡5 min，自动酶标仪上于波长600 nm处测定各孔光密度（OD）值（以实验孔OD值减去空白对照的OD值为其结果）。根据中效方程式进行中效作图，计算出各种化疗药物的半数抑制浓度（IC50）和耐药指数（resistance index,RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50）。

    1.7  流式细胞仪（FCM）分析细胞周期  将对数生长期各实验组细胞，PBS洗2次，胰酶消化，1500 rpm离心5 min,弃上清液并PBS洗涤，收集细胞后计数，制成浓度106/ml单细胞悬液，每份标本取1 ml缓慢加入-20 ℃ 70%冰乙醇固定1 h。PBS液洗2次，与含1%RNA酶的Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）共孵育10 min，碘化丙啶（PI）DNA染色，4 ℃放置30 min后上流式细胞仪，488 nm检测，并用Modfit LT2.0软件分析细胞周期。

    1.8  统计学方法  采用SPSS 11.5统计分析软件进行t检验。

    2  结果

    2.1  HE-光镜下细胞形态  QGY-7703/cDDP+cDDP和HepG2/ADM+ADM治疗组光镜下可见肝癌细胞呈巢状分布，细胞棱角减少、变钝，胞质致密、嗜酸性染色增强；胞核大，染色质疏松，有明显核仁；胞浆丰富，癌细胞间见少量血窦。其他治疗组光镜下可见程度不一的癌细胞排列紊乱，细胞在大小和形态上呈非均质化，胞浆嗜酸性染色减弱，有核浓缩、核碎裂和溶解。

    2.2  透射电镜细胞超微结构  QGY-7703/cDDP+ADM和HepG2/ADM+cDDP治疗组可见肝癌细胞不规则、体积大，有大量微绒毛。细胞器不发达、胞浆中颗粒较多、核/浆比值高、细胞核常染色质丰富、核仁大(2-3A)，而且常可以看到多核巨细胞。其他给药组见细胞程度不同的胞质内空泡化，胞浆体形成，细胞核明显变小，部分胞核成分叶状，可见核固缩，核膜皱缩、内陷，染色质凝集（见图1）。线粒体肿胀、嵴消失，线粒体基质中大量致密颗粒，可见次级凋亡小体和（或）成簇状凋亡小体（见图2），包含有核裂解碎片和内质网、线粒体、高尔基复合体等其他一些细胞结构。

    图1  ×6000细胞核固缩，核膜内陷，染色质凝集 图2  ×8000成簇状凋亡小体

    2.3  生长抑制曲线和倍增时间  采用台盼蓝染色活细胞计数方法，绘制各组细胞生长曲线（见坐标图3、图4）。亲本、耐药细胞株和各单用及联合用AsT细胞组的倍增时间分别为QGY-7703组：36.372 h、45.686 h、48.236 h和50.312 h；HepG2组：42.106 h、71.762 h、82.405 h和86.346 h。

    图3  HepG2各组细胞生长曲线

    图4  QGY-7703各组细胞生长曲线

    2.4  细胞对药物敏感性  单用或联合用AsT对各组细胞的细胞毒作用，见表1，组间比较，差异有显著性（P<0.05）。AsT作用亲本细胞IC50为低浓度值，对耐药细胞IC50为高浓度值；AsT联合化疗较单用IC50明显降低。HepG2对ADM的RI为33.7、对cDDP的RI为2.5，QGY-7703对cDDP的RI为15.8，AsT单用及联合用药的RI较低。表1  各组细胞对AsT及化疗药物的敏感性注：△P<0.05 vs QGY-7703,*P<0.05 vs HepG2

    2.5  细胞周期分析  QGY-7703及单独或联合用AsT QGY-7703/cDDP与QGY-7703/cDDP及QGY-7703/cDDP+cDDP，HepG2及单独或联合用AsT HepG2/ADM与HepG2/ADM及HepG2/ADM+ADM比较，G0/G1期细胞比例明显降低，S期变化不大，G2/M期细胞比例则增高，见表2。与相应MDR肿瘤细胞比较，单独或联合用AsT细胞G0/G1期细胞比例下降，差异有显著性（P<0.01或P<0.05），G2/M期细胞比例增加，差异有显著性(P<0.01或P<0.05)。AsT单独或联合用药同来源肿瘤细胞间的变化有程度差异，但差异无显著性（P>0.05）。 表2  各组肿瘤细胞的周期分布注：*P<0.01 vs HepG2/ADM及QGY-7703/cDDP+cDDP；△P<0.05 vs QGY-7703/cDDP及HepG2/ADM+ADM

    3  讨论

    AsT是中药砒霜的主要成分，长期以来认为是一种有毒和致癌物质，因此用之十分谨慎；但中医应用砷剂治疗梅毒、牛皮癣和风湿病具有悠久历史。近年来，我国学者应用AsT治疗急性早幼粒细胞白血病取得显著成效，并且证实其机制是通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤生长，使AsT应用在血液系肿瘤治疗中显示出广阔的前景［1，2］。然而，AsT对实体瘤效果如何，能否逆转肿瘤MDR，国内外报道较少，AsT治疗MDR肝癌未见报道。为此，我们采用AsT单用或联合化疗药物作用MDR肝癌细胞，实验观察对细胞生长的影响，结果表明AsT能够抑制多种来源人肝癌MDR细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，与化疗联合应用有明显的协同效应，同时提示AsT具有部分逆转肝癌细胞MDR的作用。实验中发现AsT细胞毒作用随药物浓度增加，作用时间延长而明显增强，呈时间和剂量依赖性；与肿瘤细胞耐受药物联合使用，对细胞的杀伤作用增加，肿瘤细胞生长曲线下移，倍增时间明显延长；FCM细胞周期分析显示G0/G1期细胞减少，G2/M期细胞增多，S期变化不大。结果显示：AsT具有杀伤人肝癌MDR细胞作用，同时能够部分逆转细胞多药耐药。因此，我们认为AsT治疗肝癌的潜在价值，并且能部分逆转肿瘤细胞的MDR。

    肿瘤的发生和发展同细胞凋亡基因的变化有密切关系，细胞凋亡减少可引起肿瘤发生并导致MDR，肿瘤细胞逃避凋亡可促进其恶性转化及演进［3～5］。AsT低浓度可诱导凋亡的启动，导致肝癌细胞DNA含量改变，主要以抑制细胞增殖为主，高浓度时对肝癌细胞的作用机制以诱导凋亡为主［6］。因此，诱导细胞凋亡和逆转细胞MDR成为近年来肿瘤治疗的研究热点。本实验结果，AsT作用MDR肝癌细胞后透射电镜观察超微结构，凋亡细胞改变：体积变小，染色体凝聚成新月状，出现凋亡小体等。AsT能诱导和促进细胞凋亡发生，也切断了MDR产生的凋亡抑制途径，从而部分逆转人肝癌细胞MDR。

    本组实验因采用的细胞株（如QGY-7703）同其他文献不同，表明AsT对肝癌细胞株凋亡的诱导可能在浓度、细胞株特异性及凋亡调控机制方面存在特异性。AsT诱导肝癌细胞凋亡的作用是肯定的，但与浓度有关。低浓度时抑制细胞增殖并不是通过诱导凋亡实现，其机制有待探讨。进一步分析AsT对肝癌细胞周期的影响发现，其可阻滞细胞于G2/M期，表明AsT作用的细胞周期动力学机制可能为周期特异性药物，提示在应用时合用对S及G2/M期敏感的药物可能有助于提高疗效。综上所述，AsT在低浓度时抑制细胞增殖并没有启动凋亡，在高浓度时以诱导细胞凋亡为主；并使细胞周期阻滞于G2/M期。AsT作为一种传统中药，能有效用于肝癌化疗。但其诱导凋亡的机制、如何用于肝癌临床治疗和临床应用剂量及疗效，能否逆转细胞耐药来改善肝癌化疗效果均值得深入研究。

    ［参考文献］

    1  Cai X,Shen YL,Zhu Q,et al.Arsenic trioxide-induced apoptosis and differentiation are associated respectively with mitochondrial transmembrane potential collapse and retinoic acid signaling pathways in acute promyelocytic leukemia.Leukemia,2000,14(2):262-270.

    2  Zhu Q,Zhang JW,Zhu HQ,et al.Synergic effects of arsenic trioxide and camp during acute promyelocytic leukemia cell maturation subtends a novel signaling cross-talk.Blood,2002,99(3):1014-1022.

    3  Thomson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease.Science,1995,267(5203):1456-1562.

    4  Hino N,Higashi T,Nouso K.Apoptosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma. Liver,1996,16:123-129.

    5  Zaffaroni N,Lualdi S,Vilia R,et al.Inhibition of tolemerase activity by a distamycin derivation:effects on cell proliferation and induction of apoptosis in human cancers.Europeon Journal of Cancer,2002,38(13):1792-1801.

    6  Oketani M,Kohara K,Tuvdendroj D,et al.Inhibition by arsenic trioide of human hepatoma cell growth.Cancer Lett,2002,183(2):147.

   *基金项目：国家自然科学基金资助（编号：30370422）

    作者单位： 1 400016 重庆，重庆医科大学核医学教研室

    2 400700 重庆，重庆市第九人民医院肿瘤放疗中心

    3 400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院中心实验室

　　 (编辑：唐  城)