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【摘要】 超声微泡造影剂作为一种新型的基因转染载体，为人类疾病的基因治疗提供了一种安全、高效的新技术。目前超声微泡介导基因转染的研究已涉及心血管、肝脏、中枢神经系统等领域，在妇科疾病方面的研究还较少，应进一步优化参数,加强探索。现就超声微泡造影剂介导基因转染在妇科疾病中的应用作一综述。
【关键词】 超声微泡造影剂 妇科疾病 基因治疗
Ultrasound microbubble contrast agent and gene treatment in department of gynecology
TANG Yan,XIONG Zheng-ai.Department of Gynaecology and Obstetrics,the Second Hospital Affiliated to Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China
［Abstract］ Ultrasound microbubble contrast agent,as a new gene transfection vector,provides a secure and efficient technique for gene therapy of human diseases.Recently,the study on ultrasound-mediated microbubble destruction delivering gene have refered to the fields including cardiovascular,hepatic,central nervous system disease and so on.The related researches on gynecologic disease are less,so it is necessary to improve parameters and make farther explorements.This review describes the application of ultrasound microbubble contrast agents in gene therapy of gynecologic disease.
［Key words］ ultrasound microbubble contrast agents；gynecologic disease；gene therapy
基因治疗是妇科许多疾病治疗的研究热点及方向，已受到国内外学者的广泛关注和认可。但一直以来，由于缺乏安全有效的靶向性基因输送系统，妇科疾病基因治疗发展缓慢。这使得人们努力寻找一种既具安全性，同时又具较高转染效率的基因治疗技术。近年来，国内外学者研究发现超声微泡造影剂可作为一种新型的基因转染载体，将携带目的基因的微泡造影剂经静脉或局部注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，可明显提高局部组织、细胞的基因转染和表达。超声靶向微泡破裂技术的应用为基因治疗提供了许多特征，包括增强基因转染效率、低毒性、低免疫原性、低侵袭性、器官特异性和超声可到达靶器官的广泛适用性。超声微泡造影剂有着广阔的发展前景，其在妇科基因治疗方面必将发挥巨大的作用。
1 超声微泡造影剂简介
1.1 定义 超声微泡造影剂（microbubble contrast agent）简称微泡,是平均直径为3 μm，用材料包裹气体的小泡,是一类能显著增强医学超声检测信号的诊断试剂,它在人体血管和组织灌注检测与成像方面具有影像对比增强剂和血流示踪剂的功能,从而增强超声显像效果［1］。
1.2 常用微泡分类及效果比较 微泡的制备是将气体（空气或其他惰性气体）分散到某种特定液体（含能形成外壳以包封气泡的物质）中,再用探针型声振仪或高频振荡器制备成泡沫,成壳物质移到新的气-液界面并得以凝聚形成微气泡外壳（膜）。膜的稳定性决定微泡的稳定性,按膜材料可分为白蛋白、非离子表面活性剂、脂质体、多聚体。根据微泡的发展可分为三代［2］：第1代的膜无稳定剂,不能通过肺循环,如自由微泡；第2代的膜含半乳糖/棕榈酸或声振白蛋白等稳定剂,可通过肺循环,如Levovist,这两代微泡内均包空气，半衰期均<5 min；第3代的膜稳定剂更丰富,可通过肺循环并具器官（肝、脾）特异性，气体为烷化剂和六氟化硫等，半衰期>5 min,如Sonovue。目前第4代微泡（新型微泡）受到人们的广泛关注，它不但具有膜稳定性好、半衰期长的优点，而且具有靶向功能，即将配体黏附于微泡的表面,通过血循环聚集到特定的组织或器官,然后选择性地与相应受体结合使靶区域超声信号增强,从而达到靶向诊断与治疗的目的。不同微泡种类其基因转染效率差异显著，Wang等［3］用携带绿色荧光素基因的质粒与不同的造影剂混合,比较Sonovue、Optison和Levovist等3种造影剂的转染效率。结果显示Sonovue和Optison均能显著增加转染效率,且毒性小；Optison在没有超声作用下也能增强转染;Sonovue则随超声强度增加，转染效率提高；无超声联合作用时，Levovist则使转染下降且出现毒性作用;Optison在剂量合适时,其转染效率是Levovist的8倍,原因可解释为Optison是含有全氟碳的清蛋白微泡,这种微泡在超声照射下存留时间更长。另有学者发现Optison能与质粒直接发生相互作用,使质粒DNA进入细胞,因此,将Optison与质粒DNA提前孵化有利于转染。
2 超声微泡造影剂携带基因治疗妇科疾病的机制
2.1 微泡与基因的结合方式 微泡造影剂携带基因治疗妇科疾病主要有两种方式：（1）基因直接黏附在微泡表面［4］。由于微泡的外壳多是带正电荷的蛋白质或阳离子脂质，而质粒DNA带大量负电荷，质粒与微泡便通过静电作用吸附在一起，然后经静脉注射、宫腔内注射等多种途径注入体内，再从体外对准靶区进行适量的超声辐照破坏微泡，使表面结合的基因物质在局部释放出来，并经细胞间隙或通透性增大的细胞膜以及微泡破裂产生的局部冲击波促使基因进入靶细胞。（2）基因包裹在微泡壁层或内部［5］。已有研究表明［6，7］，质粒DNA注射入血流后很快被血清DNA酶降解和肝脏清道夫受体排除，而质粒DNA包裹入微泡壁层或内部可免受血清DNA酶的降解。由此可见，基因包裹入微泡壁层或内部可能是提高基因转染效率的有效方法之一，值得我们进一步深入研究。
2.2 超声微泡造影剂促进基因转染的机制 大多数学者认为，超声本身有促进基因转染的作用,超声微泡可加强这一作用，但机制尚不十分清楚。目前认为空化效应可能是其中的主要机制。微气泡在超声作用下产生压缩和膨胀现象，称为超声的空化效应。在低声压下，微泡产生对称性的压缩和膨胀，气泡的直径保持相对的恒定而不破裂，此称为稳态空化；在高声压时，微泡产生不对称的压缩和膨胀，最终发生内爆破裂，而伴随发生的微束、冲击波和射流等过程可使周围组织细胞壁和质膜发生可逆或不可逆的穿孔，这种现象称为瞬态空化。微泡造影剂介导的基因转染主要利用了超声的瞬态空化效应。液体中存在的微小气泡称为“空化核”，液体产生空化效应所需的最低声压称为“空化阈”。超声微泡造影剂可作为空化核，降低超声的空化阈值，在超声的作用下产生收缩和膨胀现象。超声波和微泡造影剂相互作用,其产生的空化效应和机械效应可使细胞膜通透性增加,并使直径<7 μm的微血管破裂,内皮细胞间隙增宽,甚至会使细胞膜发生暂时性的、可逆的小孔，同时微泡破裂产生的休克波作为一种驱动力量，促使从微泡上释放出来的基因进入靶细胞［8］。虽然目前空化效应和机械效应使细胞膜通透性增加被认为是该技术增强基因转染的主要机制，但超声微泡破裂技术促进基因转染的确切机制仍然不详。Bekeredjian等［9］先采用微泡和超声,然后静脉注射质粒,结果未发现任何质粒表达,提示细胞膜通透性增加不是唯一的机制。Grayburn的研究还发现Optison微泡和质粒混合,不用超声照射就能促进转染,也提示有关超声、微泡和质粒三者相互作用的机制有待进一步探索。
3 超声微泡造影剂促进基因转染治疗
妇科疾病的应用研究现状自2000年国外学者第一次报道超声微泡破碎技术用于体外基因转染以来,该技术在体内外实验中应用均取得了较显著的效果,被先后用于转染心脏、骨骼肌、肾脏、血管、肝脏、胰腺、肺、子宫、睾丸、脊柱、中枢神经系统及卵巢等。
3.1 体外实验 PTEN是近年发现的一个定位于染色体10q23的抑癌基因,与妇科肿瘤密切相关，尤以子宫内膜癌突变率最高。王斌等［10］首先用超声微泡介导PTEN基因转染体外培养的人卵巢黏液性囊腺癌细胞（SKOV3），以诊断超声剂量辐照60 s，细胞转染48 h后，采用重组基底膜侵袭模型，观察转染前后SKOV3细胞侵袭力的变化。结果发现超声微泡能够明显增效基因转染，PTEN基因可以通过抑制肿瘤细胞的侵袭力进而抑制卵巢肿瘤生长。之后，王斌等［11］进一步探讨了超声微泡造影剂促进GFP质粒转染卵巢癌（SKOV3）细胞的超声辐照参数及有效性。该实验将SKOV3细胞分为3组：第1组加入脂质体和GFP质粒；第2组加入脂质体、GFP质粒并以4 MHz，0.5 W/cm的连续波分别辐照30 s、60 s和5 min；第3组加入脂质体、质粒和微泡，并用相同能量的超声分别照射30 s、60 s、5 min，每一时间脂质体浓度分别采用2 μl/ml、5 μl/ml和10 μl/ml。转染24～48 h后用荧光显微镜、流式细胞仪评价GFP转染率。结果显示第3组的转染效率明显高于其他两组；其中脂质体5 μl/ml超声照射60 s组转染效率最高。
3.2 体内实验 早在2002年，Endoh等［12］就将宫内注射微泡携带目的基因并联合超声辐照的技术命名为“鸟枪法”（shotgun method,SGM）。在该实验中，Endoh等在实验组胎鼠的子宫内注射一定剂量的表达GFP的裸基因质粒和超声微泡，并给予一定能量的超声辐照；而对照组胎鼠子宫内只注射相同剂量的GFP裸基因。结果显示，实验组比对照组的绿色荧光蛋白表达率增加了大约103倍。笔者认为，该技术可能为阐明子宫基因疾病发生的分子机制提供新方法，同时也可能为宫内基因治疗提供了新途径。近来，国内许多学者也开始思考利用超声微泡造影剂将治疗性基因输入体内靶组织（子宫、卵巢等），从而达到治疗妇科疾病的目的。p53蛋白对癌前病变的DNA损伤,可直接或通过调控其他途径进行修复,使其恢复正常;对DNA损伤无法修复的细胞,p53蛋白则诱导其进入冬眠状态或细胞凋亡,预防发生癌变。晚期卵巢癌p53基因突变率高达70%～80%。卵巢癌细胞株CaOV3转染野生型p53基因后,细胞p53cDNA及蛋白表达同样增加,细胞生长受到明显抑制,63%的细胞生长停滞于G0～G1期,40%～50%的原位细胞凋亡检测呈阳性。彭幼玲等［13］实验表明,微泡载野生型p53基因注入荷瘤大鼠的卵巢癌瘤体内，并用超声辐照瘤体（4C1探头,谐波1.75/3.50 MHz,机械指数1.0,时间20 min,深度5 cm），与对照组相比明显提高了p53基因的转染效率（P<0.001）增强了p53蛋白的表达（P<0.001），抑制了卵巢癌的生长。
4 超声介导微泡造影剂提高基因转染效率的影响因素
超声微泡造影剂介导基因转染的影响因素很多，除超声参数外，微泡外壳和核心气体成分、微泡的大小和浓度、靶细胞的种类、基因的种类、载体种类等因素均有可能影响转染效率，而超声参数是基因转染效率的重要条件，根据不同的超声设备和微泡优化出超声破裂微泡介导基因转染的各种参数才有可能提高转染效率和应用于临床基因治疗。如Li等［14］研究表明白蛋白包裹的氟丙烷微气泡制剂要比白蛋白包裹的空气微气泡制剂的转基因效率高10倍。Wei等［15］用不同频率、发射能量和脉冲间隔时间的超声处理微泡造影剂，发现微泡在低频高声能超声波的作用下更容易破坏。Rahim等［16］以磷脂包裹的六氟化硫为超声造影剂，采用发射频率为1 MHz的探头，不断改变超声的物理参数设置，发现当声压为0.25 MPa，照射时间为10 s，脉冲重复频率为1 kHz时，可以最大限度地提高基因转染率而不损伤细胞。
5 妇科应用的安全性
人们在关注超声微泡转染基因有效性的同时也特别关注其应用的安全性。从目前的研究看来，超声协同微泡造影剂转染基因的方法较为安全，副作用发生率很低，但如果对超声辐造剂量或微泡浓度控制不当，则会对细胞生物学活性产生影响，甚至会造成细胞死亡。早在Skyba等［17］的实验中就发现超声辐照使管径≤7 μm的微血管破裂，产生外溢孔，使体外标记的红细胞外渗到血管外间质。外溢孔的数量与机械指数密切相关，机械指数分别从0.4、0.5增加到0.5、0.7时，外溢孔数量均增加2倍，而机械指数从0.7增加到1.0时，外溢孔数量仅增加30％。随后的体外实验显示，超声辐照引起细胞死亡，随着超声辐照强度的增大，基因转染效率增加，但同时细胞的死亡率也增加了。Koch等［18］使用脉冲多普勒（0.4 W/cm，1 MHz），以脂质体微泡为载体，将结合有GFP报告基因的质粒成功导入培养的犬胶质细胞瘤内，用流式细胞仪及荧光显微镜进行基因表达测定，证明60 s的超声照射可显著增加质粒的转染效率而不出现细胞死亡，但90 s的超声照射却引起较多的细胞死亡。因此，必须在妇科实验研究中进一步探讨合适的超声辐照参数，既要达到较高的转染效率，又要降低细胞的死亡率。
6 前景和展望
超声微泡造影剂作为一种安全、高效、无创的基因转染技术，为目前处于困境中的基因治疗带来了曙光。它除了克服了以往病毒性方法和非病毒性方法的不足之处，还具有很多优点。首先，可以人为控制超声波的作用部位，使目的基因在靶区表达，提高局部的疗效，而不产生全身毒副作用，降低潜在的危害。其次，超声波的作用强度和时间可以人为控制，将有可能使我们能够调控基因表达的程度。再次，超声波操作简单，在临床上易被医患接受。目前该技术的研究还处于初级阶段，探索之路依然很漫长。亟待解决的问题包括：（1）针对不同基因、不同微泡造影剂、不同的超声转染仪器以及不同的疾病应用进行参数优化；（2）增加微泡的稳定性和在组织内滞留时间的长短；（3）提高超声微泡包裹基因的效率。相信随着以上问题的逐步解决，新型超声仪器的问世，分子生物学的不断发展，其在妇科基因治疗方面必将具有更加广阔的应用前景。
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（本文编辑：齐 栩）
作者单位：400010 重庆医科大学附属第二医院妇产科