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【摘要】 目的 探讨白介素-1β(IL-1β)和瘦素(leptin)在体外培养的子宫内膜中对与着床密切相关的因子细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和金属蛋白酶9(MMP9)的影响。方法 建立子宫内膜体外培养模型，分别用不同浓度的IL-1β和leptin进行干预，并采用半定量RT-PCR方法检测ICAM-1和MMP9 mRNA的表达变化。结果 分别经不同浓度的IL-1β和leptin干预后(0.1ng/ml的IL-1β除外)，ICAM-1、MMP9 mRNA较对照组相比表达增加，且随浓度的升高，表达量呈上升趋势。结论 不同浓度的IL-1β和leptin可以通过促进子宫内膜中ICAM-1、MMP9 mRNA的表达，进而为胚胎着床做好了充分的准备。
【关键词】 白细胞介素-1;细胞间粘附分子-1;金属蛋白酶9
Objective In order to study the mechanism of the system of interleukin-1β and leptin on embryo implantation in the early stage, we have observed the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and metalloproteinase 9 (MMP9) intervened separately by different density of interleukin-1β (IL-1β)or leptin which were closely related to the implantation in the cultured human endometrial cells of the mid-secretory phase.Methods The expressions of ICAM-1 and MMP9 in the medium of model which have been intervened by IL-1β or leptin were detected by semiquantitative real time polymerase chain reaction.Results The expressions of both ICAM-1 and MMP9 mRNA were increased with the increasing density compared with the control group.Conclusion Different amounts of IL-1β and leptin can upregulate the expression of ICAM-1 and MMP9,thus they maybe make full preparation for embryo implantation.
[Key words] interleukin-1β;intercellular adhesion molecule-1;matrix metalloproteinase 9
具有着床功能的胚胎和接受能力的子宫内膜在功能和形态上的同步性是胚胎着床的关键，而正常的子宫内膜主要在排卵后6～10天允许胚胎着床称为“种植窗期”，这需要许多细胞因子如IL-1β和leptin的参与，本文通过不同浓度的IL-1β和leptin干预体外培养的分泌中期的子宫内膜，检测与胚胎粘附和侵入密切相关的ICAM-1和MMP9的表达变化，来探讨IL-1β和leptin对胚胎着床的影响。
1 材料与方法
1.1 标本来源
子宫内膜标本取自因男方因素不孕在烟台毓璜顶医院生殖中心于分泌中期行诊断性刮宫的育龄期妇女，年龄27～33岁，月经周期26～30天。刮取的子宫内膜立即放入盛有DMEM-F12培养基(DMEM培养基与F12培养基1：1混合，含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，以下简称D-F培养基)的试管中，10min内进行分离培养。
1.2 主要试剂
细胞培养基(DMEM/F12)(Hyclone)、囊胚培养液(Hyclone)、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)、胶原酶(sigma公司)、胰酶(烟台赛尔斯公司)、双抗(烟台赛尔斯公司)、IL-1β(Santa Cruz)、leptin(Peprotech)、TRIZOL(上海生物工程公司)、AMV一步法RT-PCR试剂盒(上海生物工程公司)、引物(表1)均在华大基因合成。表1 引物名称及序号
1.3 实验方法
1.3.1 子宫内膜细胞的培养[1]
将所获取的内膜放入4°C含双抗的PBS液中，反复冲洗2次去掉血液和黏液;置培养皿中，用眼科剪将内膜组织剪成1mm×1mm×1mm的组织小块;0.25g/L的胶原酶Ⅰ 37℃消化2h或4℃过夜;反复吹打消化组织，1000r/min离心10min,弃上清;再次加入培养基，吹打细胞，1000r/min离心10min，弃上清;将沉淀组织加入少量培养液，用100目的滤网过滤，并用1ml注射器末端研磨，去除组织块，将滤液中的细胞计数，以5×105/ml接种到细胞培养瓶中，24h换液，待细胞达到70%～80%融合时进行干预。
1.3.2 子宫内膜细胞的干预
将细胞培养液换成分别含有0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml的IL-1β，1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的leptin，且均不含血清细胞培养液，共培养48h后，弃上清，用PBS冲洗3遍后，加入TRIZOL，待细胞裂解后，收集裂解液，放入液氮中保存，待检。
1.3.3 总RNA的提取
将1ml的Trizol加入到EP管(1.5ml)中，振荡溶解沉淀，室温下静置5min;加入0.2ml(为总体积的1/5)的氯仿，盖好盖子。剧烈颠倒15s。然后室温下静置10min;低温4℃离心12000g×15min，离心后液体分为3层：上层无色的为总RNA，占0.5ml左右体积; 中层白色膜状的薄层为蛋白质层，下层红色的为DNA。小心地将上层液体吸出转移至另一1.5ml的EP管中，加等体积的异丙醇，约为0.3～0.4ml。振荡混匀后室温下静置10min(时间越长越好)，低温4℃离心12000g×15min。在离心前RNA通常不可见，但离心后可见RNA呈白色片状附着在管壁底部，朝着附着的反方向小心倒出上层液体，边倒边注意是否RNA还附着在壁上，剩余的水从附着的反方向用吸头吸去;加入1ml 75% DEPC处理过的乙醇，垂直振荡后低温4℃离心8000g×10min;同样方法移去上层液体，加入20μl的DEPC处理过的水或RNAase free的水。
1.3.4 测RNA的浓度、纯度
取2μl RNA加198μl的DEPC处理过的水(稀释100倍)，空白对照为200μl的DEPC处理过的水，设测A260的吸光度值，A260/A280的值在1.8～2.0之间才有意义。
1.3.5 RT-PCR反应
参照AMV一步法RT-PCR试剂盒说明书进行操作，其中β-actin的扩增条件：首轮变性94℃ 2min，变性94℃ 15s，退火49 30s，延伸72℃ 1min，终延伸72℃ 10min;MMP9的扩增条件：首轮变性94℃ 2min，变性94℃ 15s，退火50℃ 30s，延伸72℃ 1min，终延伸72℃ 10min;ICAM-1的扩增条件：首轮变性94°C 2min，变性94℃ 15s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min，终延伸72℃ 10min。样本的扩增在PCR仪中进行。
1.3.6 电泳步骤
称取固体粉末状的琼脂糖1.5g倒入1×TAE电泳缓冲液60ml的锥形瓶中，配制成2.5%的琼脂糖液体，微波炉加热使其溶液沸腾，然后冷却至50℃～60℃，再加入Goldviewna Ⅱ型核酸染料12μl，摇匀，缓慢地将琼脂糖溶液倒入灌胶板中，放入“梳子”一把，室温放置，30min后等琼脂糖胶完全凝固后拔出梳子。将凝胶连同灌胶板一起放入电泳槽中，加样孔一侧位于阴极，在加样孔里加入5μl PCR产物和6×Buffcr 2μl的混合物，然后正确连接电泳槽和电源，开始进行电泳，电压90～100V，电流2A，时间30min。
1.3.7 结果判定
电泳好的琼脂糖凝胶置于紫外透射反射仪下以Marker为标准观察结果，并以ICAM-1/β-actin、MMP9/β-actin的灰度比值，且各样本均数间采用F检验，以P<0.05为差异有显著性，以此来判断ICAM-1和MMP9的相对表达量。
2 结果
图A为分别经不同浓度IL-1β和leptin干预后ICAM-1mRNA、MMP9 mRNA的表达情况，从左向右的条带分别为经10ng/ml的IL-1β、1ng/ml的IL-1β、0.1ng/ml的IL-1β、100ng/ml的leptin、10ng/ml的leptin、1ng/ml的leptin干预后、对照组、100bp DNA marker的条带，图C为与图A相对应的β-actin条带;图B为分别经不同浓度的IL-1β和leptin干预后的表达情况，从左向右的条带分别为经0.1ng/ml的IL-1β、1ng/ml的IL-1β、10ng/ml的IL-1β、对照组、1ng/ml的leptin、10ng/ml的leptin、100ng/ml的leptin干预后、100bp DNA marker的条带，图D为与图B相对应的β-actin条带。
而分别经不同浓度IL-1β和leptin干预后ICAM-1mRNA、MMP9 mRNA的相对表达情况，以ICAM-1/β-actin、MMP9/β-actin的灰度比值来判定，图E和图F分别为ICAM-1mRNA、从左到右条形图依次代表对照组、经0.1ng/ml的IL-1β、1ng/ml的IL-1β、10ng/ml的IL-1β、1ng/ml的leptin、100ng/ml的leptin干预组的mRNA表达情况。ICAM-1和MMP9的相对表达量见表1、表2。图A 图B图C 图D图E 图F表1 不同浓度IL-1β干预后ICAM-1和MMP9的相对表达量表2 不同浓度leptin干预后ICAM-1和MMP9的相对表达量
3 讨论
IL-1β是由活化的单核/巨噬细胞分泌产生的重要免疫调节因子,具有广泛的生物学效应，可参与免疫调节介导炎症反应及致热作用，在正常生理条件下，卵细胞刺激素(FSH)在卵泡期促进血单核细胞分泌IL-1β，诱导卵细胞成熟，黄体生成激素(LH)能够促进IL-1β在人黄素化颗粒细胞上的转录表达，调节卵巢表面糖皮质类固醇的生成。此外IL-1β在胚胎着床中是主要的细胞调节剂,其通过自分泌/旁分泌方式调节生殖内分泌功能，而胚胎着床是一个复杂的生理过程，它包括早期胚胎的发育、子宫内膜容受性的建立、胚胎脱透明带、胚胎在子宫内膜上的粘附和植入等环节，涉及细胞的增殖、分化、生长发育、细胞间的相互识别和粘附、植入等作用。leptin是肥胖基因的产物,由白色脂肪细胞分泌的一种含146个氨基酸的蛋白质。其编码基因为肥胖基因(ob)，位于人第7号染色体上，主要参与调节食物摄入和能量平衡。对女性生殖功能来说,leptin 可能是代表能量状态足够的一个信号[2],作用于中枢和外周器官,启动青春期,调节女性的生殖内分泌功能;Margetic等[3]报道leptin通过调节下丘脑-垂体-性腺的功能影响性激素的合成和分泌，也可通过直接或间接的外周作用对生殖系统功能产生影响，抑或通过直接结合卵泡细胞膜表面瘦素受体影响细胞的功能，但其具体机制尚不明了。本实验通过体外培养子宫内膜细胞，观察不同浓度的IL-1β和leptin对与胚胎的粘附和侵入相关的ICAM-1和MMP9的影响，来探讨其对胚胎着床的影响。
ICAM-l(CD54)为细胞粘附分子中免疫球蛋白超家族的主要成员，ICAM-1由较复杂的细胞外区、疏水的跨膜区和较短的胞质内区构成。ICAM-1细胞外区由5个免疫球蛋白(Ig)样结构组成，分别有5个单独的外显子编码;跨膜区、信号肽和胞质尾区则分别有两个不同的外显子编码。ICAM-1蛋白分子含有505个氨基酸，可以二聚体形式低表达于多种组织细胞的表面和细胞外基质，它分布广泛，在上皮细胞、内皮细胞、白细胞、巨噬细胞及成纤维细胞上都有表达，主要作用是介导细胞与细胞间的粘附，具有参与急性期炎症反应时的白细胞浸润、调节机体免疫等多种功能，且对胚胎着床过程中介导子宫内膜容受性的建立和胚泡在子宫内膜的粘附发挥着重要作用。ICAM-1在生理条件下表达水平较低;当受到炎性细胞因子[如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素7(IFN-7)等]刺激后ICAM-1表达明显增多。Salafia等[4]研究还发现，ICAM-l在蜕膜细胞及滋养层细胞的表达与着床密切相关，参与母胎细胞群的相互作用。Burrows等[5]研究发现ICAM-1 mRNA在孕早期蜕膜和绒毛膜的血管内皮细胞上都有表达，它的同族成员血管细胞黏附分子(VCAM)的表达量还与着床位点有关。ICAM-1在整个月经周期的子宫内膜的血管内皮中有规律性地表达，提示它可能参与了妊娠早期的生理过程。本实验分别通过用不同浓度的IL-1β(除外0.1ng/ml)和leptin干预后ICAM-1的表达较对照组相比，mRNA的表达量增加，且随着IL-1β和leptin浓度的增加，呈现上升趋势。此外还有研究表明ICAM-1在胚泡[6]上也有表达，可以通过与其配体如淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和巨噬细胞抗原复合体-1(Mac-1)等结合来介导胚泡与内膜间的粘附，并且1CAM-1/IFA-1结合是母胎接合面免疫耐受和免疫整合的主要调节者[7]，ICAM-1/LFA-1对导致前炎性细胞因子迁移至着床位点，促使蜕膜的树突状细胞成熟，诱发局部辅助T细胞(Th1)增加并参与母胎面的免疫耐受形成，避免了子宫内膜对胚泡的免疫排斥作用，进而有利于胚泡的着床。此外还有学者通过RT-PCR的方法研究[8]IL-1β可以上调小鼠子宫内膜细胞中ICAM-1 mRNA的表达，增强胚胎的种植能力，提高着床率。故而通过本实验可以看出IL-1β和leptin通过上调ICAM-1的表达，进而促进母胎面的免疫耐受形成和胚泡在子宫内膜的粘附。
胚泡的植入是继在子宫内膜粘附后的重要环节，细胞外基质的降解又是胚胎植入过程中的关键步骤，而MMP9是一族降解ECM成分的中性含锌蛋白酶类，它可降解变性胶原分子及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原。Leco等[9]发现MMP9特异性高表达于着床部位，可能是参与胚胎着床过程中细胞外基质降解的重要调节因素之一。 Castellucci[10]报道，当与胚胎侵入有关的MMP9在局部浓度较高时，它可以发挥酶解作用消化蜕膜基质、基底膜，为胚胎绒毛外滋养细胞侵袭螺旋小动脉变异，加速完成血管重塑过程，较快建立子宫胎盘血液循环。李黎等[11]发现体外培养的分泌中期内膜细胞分泌的MMP9是IL-1β浓度依赖性的，不断增加IL-1β的浓度可引起MMP9的表达量稳定增长，人子宫内膜基质细胞表面存在有IL-1R,基质细胞通过自分泌/旁分泌等途径分泌IL-1,与IL-1R结合促进内膜细胞分泌MMP9，降解胞外基质，有利于绒毛滋养层细胞侵入子宫内膜，促进胚胎着床。为了验证以上结论，本实验在体外培养的子宫内膜中，分别用不同浓度IL-1β、lepitn干预后采用半定量RT-PCR的方法检测子宫内膜细胞MMP9 mRNA的表达，结果提示：随着IL-1β、leptin的干预浓度升高，可以促进子宫内膜细胞MMP9的分泌增加，降解细胞外基质，有利于绒毛滋养细胞侵入子宫内膜，促进胚胎植入。
笔者认为，在体外不同浓度的IL-1β和leptin能促进子宫内膜细胞ICAM-1和MMP9的表达，有利于胚胎粘附和植入，为提高体外受精-胚胎移植过程中胚胎种植率和临床妊娠率，提供有价值的理论依据。
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