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基金项目:国家自然科学基金资助课题（批准号:39800065）
【摘要】 目的 研究内源性一氧化碳（CO）及其合成酶—血红素氧化酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）在冠状动脉粥样硬化疾病发展中的变化规律。方法 通过逆转录PCR、原位杂交、免疫组织化学染色、生物化学多项指标观察动脉粥样硬化发病过程中HO-1和CO等相关指标变化规律。结果 原位杂交显示实验组兔冠状动脉内皮细胞有HO-1mRNA表达，免疫组化显示在冠状动脉内皮细胞HO-1蛋白呈阳性反应。且随动脉粥样硬化的发展，其在冠状动脉的表达有逐渐增高的趋势。RT-PCR也观察到相同的结果。其冠状动脉壁血红素氧化酶活性、CO浓度及cGMP含量有逐渐增高的趋势。结论 CO及HO-1在动脉粥样硬化发病过程中可能具有重要作用。
关键词 内源性一氧化碳 血红素氧化酶-1 冠状动脉粥样硬化
The change on endogenous carbon monoxide and heme oxygenase-1 of coronary artery during atherosclerosis
Yu Lu，Zhang Qinghua
Department of Kidney，305Hospital of People Liberation Army，Beijing100017.
【Abstract】 Objective To research the regularity of endogenous carbon monoxide（CO）and heme oxygenase-1（HO-1）during atherosclerosis development in rabbit.Methods RT-PCR，in situ ybridization，immunohistochemistry stain，and some biochemical index marks were performed so as to research the regularity of CO and HO-1during atherosclerosis development.Results The positive score of HO-1mRNA is distributed in endothelial cell of coronary artery，the express of HO-1mRNA on coronary artery increase in process of time during atherosclerosis development.The positive
score of HO-1protein is distributed in endothelial cell of coronary artery，the express of HO-1protein on coroˉnary artery raises in process of time during atherosclerosis development.Through RT-PCR method，the express of HO-1mRNAon coronary artery raises in process of time during atherosclerosis development was observed.The activity of HO-1，the concentration of CO and cGMP increase inprocess of time during atheroscleosis development.Conclusion CO and HO may play an important role in atherosclerosis development.
Key words endogenous carbon monoxide heme oxygenase-1 atherosclerosis
近年的研究发现内源性一氧化碳（CO）是一种新型的信使分子。作为内源性一氧化碳合成的限速酶和关键酶，即血红素氧化酶（Heme Oxygenase，HO）已被证实几乎分布于所有器官和组织 ［1］ ，HO-1和CO在动脉粥样硬化发生机制中的作用，目前罕见报告。本研究采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）、分子原位杂交、免疫组织化学染色等多项指标，从不同侧面研究CO及其合成酶HO-1在动脉粥样硬化发病中的作用机制，旨在为动脉粥样硬化的发病机理及防治探索一条新的途径。
1 材料和方法
1.1 动脉粥样硬化的动物模型制备及分组 实验动物:新西兰大白兔，雄性，120只，体重0.5～1.1kg，实验总时间为12周，由本校动物所提供。采用随机法分为5组（对照组及四个实验组），每组24只，分笼饲养。对照组食用基础饲料，而实验组添加胆固醇粉1g/天/只，于傍晚给药。于喂养的第2、4、8、12周分别将各实验组及对照组的兔颈动脉放血处死。
1.2 HO-1免疫组化染色（SP法） 将心肌及冠状动脉进行石蜡包埋、切片厚度为6μm。HO-1单抗的稀释度为1/250，其余按常规步骤进行。用PBS代替抗体作为阴性对照。阳性为棕黄色。
1.3 HO-1mRNA的原位杂交 pRHO1（HO-1）cDNA质粒由日本Toshisuke教授惠赠。经过转化、扩增、抽提与纯化、酶切鉴定后，用宝灵曼的地高辛标记检测试剂盒进行标记。将心肌及其冠状动脉的石蜡标本切片，厚度为6μm。按常规步骤进行。阴性对照:（1）杂交前用RNase100μg/ml37℃1h预处理组织（消化mRNA）切片。（2）用未标记的pRHO1cDNA探针进行杂交反应。
1.4 反转录聚合酶链式反应测定冠状动脉HO-1mRNA表达 总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法。采用显微分离法分离冠状动脉，利用Promega提供的试剂进行提取冠状动脉总RNA。反转录聚合酶链式反应:采用随机引物法。聚合酶链式反应扩增HO-1和β-肌动蛋白（β-actin）特异性片段。扩增HO-1cDNA特异性片段的引物是根据Toshisuke发表的鼠HO-1特异性引物的序列确定的。上游引物为5′-GAATTCAGCATGCCCCAGGTGGT-3′，下游引物为5′-TCTAGACTAGCTGGATGTTGAGCAGGA-3′。在进行RT-PCR的同时扩增鼠β-actin用作内参照，保证每次实验的相对可比性，扩增鼠β-actin特异性片段的上游引物为5′-GCG GGA AAT CGT GCT ACA TT-3′，下游引物为5′-GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′。94℃1min，50℃1min，72℃1min。首轮循环95℃2min，最后72℃延伸5min，共进行30次循环。然后进行1%琼脂糖电泳分析。
1.5 HO活性测定 冠状动脉分离后，按文献方法 ［2］ 测定HO活性。根据在464nm和530nm处的光吸收推算出，胆红素的消光系数为401/mmol/Lcm。 蛋白定量采用考马斯亮蓝法。
1.6 CO含量测定 按文献方法 ［3］ 测定CO活性。
1.7 放免法测定冠状动脉cGMP含量 按 125 I标记试剂盒说明书进行。
1.8 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，采用Microsoft Excel97数据分析统计程序进行单因素方差分析及部分指标相关分析。
2 结果
2.1 冠状动脉HO-1mRNA的表达 原位杂交法检测显示在正常情况下冠状动脉HO-1mRNA表达较少，随着实验性动脉粥样硬化的发展，在实验组第2周（图1），12周（图2）内皮细胞HO-1mRNA的表达逐渐增强，阴性对照组中冠状动脉内皮细胞呈阴性反应。
2.2 冠状动脉HO-1免疫组织化学染色的变化 对照组冠状动脉内皮细胞在HO-1呈弱阳性反应、第二周实验组中冠状动脉内皮细胞的HO-1呈局灶性弱阳性反应，但在心肌间质毛细血管内皮及心肌细胞索周膜内呈阳性;第四周实验组的冠状动脉内皮细胞内HO-1呈弱阳性反应，冠状动脉分支内皮细胞呈阳性或弱阳性反应;部分心肌细胞呈片状阳性反应;第八周实验组中冠状动脉内皮细胞、心内膜内皮细胞、心肌小血管及毛细血管内皮细胞和心肌细胞索周膜的HO-1呈阳性反应;第十二周实验组中冠状动脉内皮细胞的HO-1呈强阳性（图3），而心内膜内皮细胞也呈强阳性反应。阴性对照:冠状动脉内皮细胞HO-1呈阴性。
2.3 冠状动脉HO-1mRNA表达图像分析、HO活力（pmol/mg.pr/h）、CO（μg/mg）及cGMP（pmol/L）浓度变化 见表1。 表1 冠状动脉血红素氧化酶-1mRNA表达图像分析、血红素氧化酶活力（pmoL/mg.pr/h）、内源性一氧化碳（μg/mg）及鸟苷酸环化酶（pmol/L）浓度变化 （略）
注:与前一时相点相比: a P<0.01
RT-PCR检测到，第二周时HO-1mRNA的表达开始增加，随着动脉粥样硬化的逐渐进展，mRNA的表达量逐渐增加，第12周时mRNA的表达仍较高。β-actin的表达在各时相点之间表达量无明显变化（图4略）。从表可见随着动脉粥样硬化的发展冠 状动脉HO的活性、CO含量及cGMP也逐渐增高，并且每一时相点与前一时相点相比呈非常显著性增加（P均<0.01）。相关分析表明内源性一氧化碳的含量和cGMP的浓度呈非常明显的正相关（r=0.99259，P<0.01）。
3 讨论
心血管疾病死亡率在我国疾病死亡率居第一或第二位，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率与死亡率在逐年上升。尽管150年来，关于动脉粥样硬化的发病机制已提出许多学说，但很多问题仍不清楚。目前国外研究表明CO在调节细胞功能和细胞相互作用方面起着重要的作用。实验已经证明在脑中CO是一种新型的神经信使，而HO-1的可被诱生的性质使其不仅在机体正常生理状态下，而更主要在机体的病理状态或应激状态下亦发挥作用 ［4］ 。HO-1和CO在动脉粥样硬化发病机制中的作用，目前罕见报道。我们通过免疫组化染色和原位杂交研究发现HO-1主要存在于冠状动脉和主动脉的内皮细胞层 ［5，6］ ，并随着主动脉壁和冠状动脉的内皮和内皮下动脉粥样硬化发病变逐渐加重，HO-1mRNA表达和蛋白表达呈动态进行性增强的趋势。1998年5月Wang应用原位杂交在人和动物中研究了HO-1在主动脉粥样硬化损伤部位的分布状态，也发现HO-1mRNA主要分布于内皮细胞层和损伤部位增厚内膜的泡沫细胞/巨噬细胞 ［7］ 。这与我们在主动脉和冠状动脉上所进行原位杂交的结果是一致的 ［5，6］ 。我们从RT-PCR结果也观察到随着动脉粥样硬化的发展冠状动脉HO-1mRNA的表达强度逐渐增高。这与原位杂交所观察到的结果是一致的。国外一些研究者在其他疾病的生理和病理过程中也观察到HO-1在疾病的不同时期其基因和功能会有所改变。我们在冠状动脉HO-1的功能研究也发现，随着动脉粥样硬化的发展HO-1活性、CO的浓度和cGMP的含量逐渐增高。众所周知内皮素与动脉粥样硬化的发展有密切的关系。1995年Toshisuke报道证实cGMP增多抑制ET的产 生 ［8］ 。我们的研究和国外的研究均表明，CO含量增高导致cGMP增高。综合我们的研究及他人的报道，可以认为在动脉粥样硬化发展过程中可能存在某种因素刺激HO-1mRNA的表达，使