p38MAPK在肝癌发病中的作用

　　【摘要】 目的 最近研究表明，Ras-MAPK信号转导通路在肝癌的发生和发展中起着重要作用，p38MAPK是Ras-MAPK信号转导通路中的一关键分子。本研究拟探讨p38MAPK在肝癌发病中的作用。方法 用脂质体转染法将survivin反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASO）导入肝癌细胞系SMMC-7721细胞中，通过细胞凋亡、p38MAPK含量、p38MAPK表达和p38MAPK活性的变化检测p38MAPK在肝癌发病中的作用。结果 survivin反义寡核苷酸作用SMMC-7721细胞48h后凋亡细胞比率、p38MAPK含量、p38MAPK表达和p38MAPK活性分别为对照组的5.3倍、4.6倍、5.1倍和6.3倍，差异有显著性（P<0.05）。结论 p38MAPK通过介导凋亡信号而在肝癌的发病中起重要作用。

　　关键词 肝癌 反义寡核苷酸 丝裂原活化的蛋白激酶 信号转导
     
　　The role of p38mitogen-activated protein kinase in the  pathogenesis of liver cancer
     
　　Song Tingting，Li Miaoyu，Jiang Yuhua，et al.
   
　　Department of Recuperation，Qingdao Tumor Hospital，Shandong266042
   
　　【Abstract】 Objective To study of the role of p38mitogen-activated protein kinase（p38MAPK）in the pathoˉgenesis of liver cancer.Methods After survivin antisense oligodeoxynucleotide（ASO）was introduced into SMMC-7721cell line by liposomal transfection，the effect was evaluated by apoptosis，p38MAPK content，p38MAPK expression and p38MAPK activity.Results The rate of apoptotic cells，p38MAPK content，p38MAPK expression and p38MAPK activity were4.3，3.6，4.1and5.3times higher than that in control group respectively（P<0.05）after48hours treatment by ASO.Conclusion p38MAPK plays an important role in the pathogenesis of liver cancer by directing apoptotic signal transduction.
   
　　Key words liver cancer antisense oligodeoxynucleotide mitogen-activated protein kinase signal transduction 

　　肝癌（liver cancer）是消化系统的恶性肿瘤，发病率高，预后差，目前缺乏有效的治疗方法 ［1］  。最近研究表明肝癌的发生与其异常Ras-MAPK信号转导有关 ［2］  。信号转导是指细胞感知胞外刺激后，通过细胞内信号分子的逐级传递作用，最终诱导产生一系列的细胞质、细胞核内事件和各种生理生化反应的过程 ［3］  。Ras-MAPK信号转导通路参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程，p38MAPK是Ras-MAPK信号转导通路中的一重要分子，它除在细胞应激、炎症反应中具有重要作用外，也与细胞的发育、分化和凋亡密切相关 ［4］  。有关p38MAPK在肝癌发病中作用的研究目前报道不一，鉴于此，笔者以反义技术为研究手段，以肝癌细胞系SMMC-7721为研究对象，探讨p38MAPK在肝癌发病中的作用，以期为肝癌的基础研究和临床治疗探讨一项更彻底、更有效的途径。
    
　　1 材料与方法
   
　　1.1 材料 脂质体、兔抗人MAPK单克隆抗体、过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（IgG）、RPMI1640为Sigma公司产品。Trizol试剂盒、p38MAPK活性检测试剂盒、［γ- 32  P］ATP（111TBq/mmol）为美国GIBCO公司产品。SMMC-7721细胞用含5%小牛血清的RPMI1640培养。全硫代修饰的survivin基因反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASO）序列为:5’-GGGGCACCCATGCCGCCGCC-3’，无关核苷酸（ODN）序列为:5’-CATTTCTTGCTCTCCACACT-3’，经计算机检索与包括survivin基因在内的人类基因无同源性。以上序列由Takara公司合成。

　　1.2 方法
   
　　1.2.1 ODN的脂质体转染 将ODN和脂质体（liˉposomal，Lipo）分别稀释成4μmol/L和80μg/ml，两者等容积混合，制备成脂质体包裹的ODN母液。将ODN母液加入培养板中，调整ODN的终浓度为1μmol/L，Lipo终浓度为20μg/ml，培养12h弃上清，再加入含相同ODN浓度的培养液，培养48h后依次进行以下实验。
   
　　1.2.2 实验分组 分为对照组（仅加细胞悬液，Con）、无关ODN组（Non）、脂质体组（Lipo）和处理组（ASO），每组设3个复孔，结果取均值。
   
　　1.2.3 细胞凋亡检测 采用片段DNA含量测定法。收集以上各组细胞（3×10 6 ），PBS洗3次后，加入0.2%TritonX-100裂解细胞，高速离心，上清和沉淀分别含片断DNA和完整DNA。二者经12.5%三氯醋酸重新沉淀后，再次溶于80μl5%的三氯醋酸中，90℃热解10min。所含DNA用二苯胺试剂显色、定量（590nm）。片断DNA（%）=片断DNA/（片断DNA+完整DNA）×100%
   
　　1.2.4 p38MAPK含量 采用免疫印迹法（western blot）法。细胞裂解液经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，丽春红S染色标记。PBˉST室温封闭1h，先后加入一抗（兔抗人MAPK单克隆抗体，1∶2000稀释度）和二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，1∶1000稀释度），室温下分别孵育1h。膜与化学发光增强剂反应5min后曝光。经显影和定影，激光光密度扫描仪测定免疫印迹区带的光密度。
   
　　1.2.5 p38MAPK表达的检测 采用FCM。分别收集以上各组细胞约3×10 6 个，1500r/min×5min离心，弃上清，PBS液洗涤1次，80%预冷乙醇（-20℃）固定细胞2h以上，用含1%牛血清白蛋白的PBS液洗涤，将细胞重悬浮于PBS含0.25%TritonX-100的染色应用液中，冰浴5min后，离心弃上清，加入用含1%牛血清白蛋白的PBS液稀释（1∶2000）的兔抗人MAPK单克隆抗体（第一抗体），4℃孵育过夜，加入按1∶50稀释的羊抗兔荧光二抗，室温孵育30min，离心弃上清，重悬浮于200μl PBS液中，待测。
   
　　1.2.6 p38MAPK活性检测 采用γ- 32  P掺入法。按p38MAPK活性检测试剂盒和 ［5］  进行，于β液闪仪上检测其放射活性。
   
　　1.2.7 统计学方法 实验结果以ˉx±s表示，组间比较采用t检验，率的变化采用χ 2 检验。

　　2 结果
   
　　2.1 对细胞凋亡的影响 以上各组细胞经相应处理后，测得片段DNA含量（%）:Con组为6.3±1.5、Non组为7.1±2.8、Lipo组为7.6±0.4、ASO组为33.1±1.7（与其它3组比较，P<0.05）。
   
　　2.2 p38MAPK含量的变化 以上各组细胞与ASO 作用48h后，免疫印迹法测得各免疫印迹区带的发光强度各不相同，其中ASO组免疫印迹区带的发光强度最显著，是Con组4.6倍，见表1。
   
　　2.3 p38MAPK表达的变化 各组细胞经不同处理后，流式细胞仪检测显示，各组细胞吸光度值均不相同，ASO组细胞吸光度值最高，是Con组5.1倍，见表1。
   
　　2.4 p38MAPK活性的变化 SMMC-7721细胞与ASO作用48h后，γ- 32  P掺入法测得各组MAPK活性均不相同，见表1，ASO组MAPK的活性是Con组的6.3倍。

　　表1 反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞MAPK的影响 （略）

　　注:与其他3组比较， ˇ P<0.05
    
　　3 讨论

　　survivin是新近发现的一种凋亡抑制蛋白（inˉhibitor of apoptosis，IAP）家族成员，特异地表达于胚胎发育组织和多数人类肿瘤细胞 ［6］  ，在肝癌细胞中survivin高表达 ［7］  。survivin基因抑制细胞凋亡是肝癌的基本发病机制，反义survivin寡核苷酸导入肝癌细胞可阻断survivin蛋白表达，诱导细胞凋亡，这一反义核酸技术已成为研究survivin抗凋亡作用机制的理想模型。我们在实验中用ASO处理SMMC-7721细胞，测得凋亡细胞所特有的片段DNA含量明显增多，证明细胞发生了凋亡。
   
　　p38MAPK通路是1993年发现的一类MAPK通路，在细胞信号转导起重要作用，它能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞一系列生物学反应。1994年，Han等 ［8］  首先在小鼠肝脏细胞中克隆了p38MAPK基因，同时发现其在小鼠巨噬细胞和淋巴细胞中均有表达。Sen等 ［9］  发现IL-1和TNF-α可以激活胸腺细胞中的p38MAPK，说明p38MAPK参与胸腺细胞的发育和分化。研究表明，脂多糖、紫杉醇和蛋白激酶C的特异激活剂PMA可以快速诱导某些细胞内的p38MAPK发生酪氨酸磷酸化。对胶质瘤的研究显示，多巴胺、高渗和LPS等可激活p38MAPK。Hernandez等 ［10］  曾在人星形胶质瘤细胞株中发现，p38MAPK可使TNF-α诱导cPLA2磷酸化，提示p38MAPK在人胶质瘤细胞中表达并发挥作用。在对凋亡的调节中，p38MAPK也发挥了重要的作用，p38MAPK通路的激活可导致神经细胞凋亡，而ERK通路的激活则抑制其凋亡。已有的研究证实p38MAPK在肿瘤中活性升高并能诱导凋亡的发生。在去除血清导致的结肠腺癌细胞凋亡中，p38MAPK得以激活并介导了凋亡 ［11］  。在PKC特异性抑制剂calphostin C诱导人胶质瘤细胞凋亡的研究中，Ozaki等 ［12］  检测到p38MAPK的活性升高。
   
　　本实验中，笔者利用脂质体转染的方法将surˉvivin ASO导入SMMC-7721细胞中，成功地建立了肝癌细胞凋亡模型，为进一步阐明p38MAPK在肝癌发病中的作用打下基础。研究发现，正常SMMC-7721细胞中p38MAPK有一定量的基础表达，但表达量较低，免疫印迹法、FCM和γ- 32  P掺入法测得p38MAPK含量、表达和活性分别为0.78±0.2、0.51±0.7和9.8±0.6。转染survivin反义寡核苷酸后p38MAPK的表达量明显增加，其含量、表达和活性分别升至为3.62±0.7、2.60±0.3和61.6±1.9。这说明封闭survivin基因的表达可引起p38MAPK的活化，p38MAPK在survivin反义寡核苷酸诱导的肝癌细胞凋亡中起重要作用，凋亡信号可能通过p38MAPK信号通路向下游传递。从另一方面也说明，survivin癌基因阻止肝癌细胞凋亡可能是通过抑制p38MAPK活性来实现的。这一结果也提示p38MAPK有可能成为治疗肝癌的新靶标，即通过调节p38MAPK的活性达到治疗肝癌的目的。
    
　　（本稿由第一军医大学珠江医院血液科尚振川副教授推荐）

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　　12 Ozaki I，Tani E，Ikemoto H，et al.Activation of stress-activated proˉtein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase and p38kinase in calphostin C-induced apoptosis requires caspase-3-like proteases but is disˉpensable for cell death.J Biol Chem，1999，274（9）:5310-5317.
    
　　（收稿日期:2004-11-09）

　　（编辑晓 青）

　　作者单位:266042山东青岛青岛市肿瘤医院康复科（ △ 中西医科）