点击显示 收起
【摘要】 目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。 方法 获取成年大鼠胫骨干骨髓，采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代，观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。 结果 大鼠骨髓基质细胞贴壁呈集落生长，5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞。 结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。
关键词 骨髓间充质干细胞 细胞培养
【Abstract】 Objective To investigate the factors of growth and cardiogenic differentiation of rat mesenchymal stem cells in vitro.Methods Mesenchymal stem cells were isolated and culture-expanded，and the cardiomyogenic induction was started by adding5-azacitidine to the culture medium，and the proliferation and differentiation of the proliferation and differentiation of them were observed.Results Mesenchymal stem cells were spindle-shaped and active proliferation capacity in vitro，and theywere differentiated into cardiac-like muscle cells after adding5-azaci-tidine.Conclusion Cardiomyocytes could be induced from MSC in vitro.
Key words mesenchymal stem cells cell culture
骨髓组织除含有造血干细胞以外，还含有骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）。近来研究发现其在不同的诱导条件下，具有向中胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等分化的能力，随着细胞工程学和组织工程学的发展，利用MSC的多向分化性及其可在体外表达多种外源目的基因的特性，将其作为种子细胞用于细胞治疗和基因治疗的研究已成为当前研究的热点 ［1］ 。本实验对SD大鼠MSC进行培养，并采用5-氮胞苷体外诱导，旨在探索一种体外分离培养自体心肌细胞的方法，为MSC临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂 实验动物:雄性SD大鼠50只，体重（250±50）g，（宁夏医学院实验动物中心提供）。试剂:IMDM细胞培养基（Sigma公司），胎牛血清（Gibco公司），双抗（青霉素、链霉素）（Sigma公司），5-氮胞苷（Sigma公司），小鼠抗大鼠的结蛋白多抗（福建迈新公司），小鼠抗人的心脏肌钙蛋白Ⅰ单抗（Sigma公司）
1.2 实验方法
1.2.1 骨髓间充质干细胞培养、传代 （1）氯胺酮麻醉（100mg/kg），穿刺下肢胫骨，抽取骨髓;（2）将抽取的骨髓加入内含PBS溶液10ml离心管中，吹打均匀，离心，1500rpm，5min;（3）弃去上清，沉淀后加入含20%胎牛血清的IMDM培养液5ml，吹打均匀，加入25cm 2 的培养瓶中，37℃，5%CO 2 培养箱中培养;（4）原代培养的细胞72h后第1次换液，以后每48h换液1次;（5）传代培养:细胞密度接近80%时按1∶3进行传代。
1.2.2 骨髓间充质干细胞的分化诱导 采用第4代细胞，传代后第3天加入5-氮胞苷（5-aza），终浓度为10μmol/L，24h后换新鲜培养液，以后每隔1～2d换液，不再传代。倒置显微镜观察细胞形态变化。
1.2.3 免疫组化 采用辣根过氧化物酶—链霉菌抗生物素法（SP法）:分别对诱导后6周的MSC和未诱导的MSC进行结蛋白、cTnI免疫组化检查。
2 结果
2.1 培养的MSC细胞特征 刚接种的MSC悬液中细胞呈圆形，24h后，部分细胞沉淀在瓶底，开始贴壁之后，细胞数量明显增加，体积增大，排列开始出现一定的方向性，呈克隆生长;7～9d后进行第1次传代，约传代后3d即可铺满了全层，呈鹅卵石样。
2.2 诱导后MSC的形态学特征 倒置显微镜下发现，诱导后MSC增生趋于停滞，诱导后10d左右可见MSC细胞由原来多角形变成长梭状，15d后部分细胞胞体增粗，可见细胞间有融合，20d左右类似肌管样细胞出现。
2.3 免疫组化 未干预的MSCs细胞未见到结蛋白阳性及cTnI阳性细胞，在诱导6周后的MSCs细胞结蛋白呈阳性（图1），cTnI呈阳性细胞（图2）。
图1 诱导6周后的MSC细胞结蛋白免疫组化
图2 诱导6周后的MSC细胞cTnI免疫组化
3 讨论
心肌细胞起源于中胚层，在胚胎发育的早期中胚层向心肌细胞分化已完成，在胚胎发育后期及出生后心肌细胞主要发育成熟和细胞体积增大，只有极少一部分心肌细胞具有增殖能力，无法完成细胞损伤的修复。因此，心肌梗死后心肌无法自身修复，只能形成瘢痕组织。干细胞具有多向分化能力，可以分化为各种细胞，采用干细胞移植作为一种修复心肌损伤的方法，在国外受到多方关注，尤其是自体骨髓间充质干细胞，将是今后心脏细胞移植研究的主要方向。本实验发现大鼠骨髓基质细胞在诱导剂5-氮胞苷的作用下，可以向心肌样细胞方向转化。形态学上MSC细胞在5-aza干预后细胞由原来扁平多角形变成长梭状，部分细胞胞体明显增粗，可见到有些细胞间有融合样情况发生，可以有类似肌管样细胞出现。结蛋白属于细胞骨架蛋白，是心肌和骨骼肌细胞肌丝中的一种中间丝蛋白。cTnI仅存在于心房肌和心室肌中，且只有一种TnI存在，胎儿、新生儿及成年人各阶段的cTnI均相同。结蛋白和cTnI免疫组化染色阳性表明MSC已经向肌细胞转化。至于5-氮胞苷促进MSCs向肌细胞转化的机制尚不清楚，有学者研究认为 ［2～4］ 5-aza是胞嘧啶核甙的一个类似物，能引起DNA中某些胞嘧啶的去甲基化，从而参与激活表型特异性的基因，如MyoD。MyoD基因在甲基化状态下含有一个肌源性决定部位，一般处于转录失活状态。用5-aza诱导后，这个部位去甲基化，转录激活，引起细胞向肌源性细胞分化。骨髓间充质干细胞具有向心肌细胞转化的潜能，并且由于其可自体移植，不存在免疫排斥，其将为细胞移植治疗冠心病提供一种良好的细胞来源。
参考文献
1 Minguell JJ，Erices A，Conget P.Mesenchymal stem cells.Exp Biol Med，2001，226（6）:507-520.
2 Makino S，Fuknda K，Migoshi S，et al.Cardiomyocytes can be gener-ated frommarrow stromal cells in vitro.J Clin Invest，1999，103:697- 705.
3 Wang JS，Tim DS，Galipeau J，et al.Marrow stromal cells for cellar cardiomyoplasty:feasibility and potential clinical advantages.Thorac cardiovasc surg，2000，120:999-1006.
4 Tomita S，Li RK，Weisel RD，et al.Autologous transplantation of bone marrow cells improves changed heart function.Circulation，1999，100（SupplⅡ）:247-256.
（编辑深 蓝）
作者单位:750004宁夏医学院附属医院心内科