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【摘要】目的探讨氧化应激与细胞凋亡在应激性溃疡发病中的作用及相关性。方法改良Allen法制造颅脑损伤并发应激性溃疡模型，40只大鼠随机分为正常对照和应激后3、6、12、24h组。测定溃疡指数(UI)、胃黏膜超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)；透射电镜及流式细胞仪检测早期细胞凋亡。结果颅脑损伤6h后各应激组UI增加；胃黏膜SOD下降，MDA升高，于应激后3h即有显著变化，6～12h达高峰；早期细胞凋亡率于应激后6h开始显著增多，12h达高峰；应激后6h透射电镜可见凋亡细胞，12h显著增多达高峰。SOD、MDA变化分别与细胞凋亡率的变化呈显著相关性，且时间上早于后者。结论细胞凋亡参与急性胃黏膜损伤。氧化应激是应激性胃黏膜损害的重要因素，可能参与导致细胞凋亡。
关键词:氧自由基;细胞凋亡;应激性溃疡发病机制
Effect of oxygen free radical and apoptosis on stress ulcer in rats
Wang Tianyi,Zhu Yuqun,Yang Zhaoxu
Department of Gastroenterology,Tiantan Hospital Affiliated to Capital University of Medical Science,Beijing 100050.
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of oxidative stress and apoptosis on the pathogenesis of stress ulcer and the correlation between them.MethodsThe rat model of acute craniocerebral injury complicated with stress ulcer was duplicated by modified Allen’s.40 rats were randomly divided into control group and 3,6,12,24h groups after stress.The ulcer indexes(UI)and the contents of SOD and MDA of mucosa tissues were detected.The index of earlier apoptosis was detected by both FCM and transmission electron microscope(TEM).ResultsThe UI grew with time after stress 6h.The activities of SOD decreased while the levels of MDA increased after stress.The significant change was detected at 3h and rose to a peak at 6～12h.Change of indexes of earlier apoptosis by FCM increased obviously at 6h,and the peak was at 12h.The apoptotic cell was detected at 6h under TEM,and the number peaked at 12h.The indexes of oxidative stress had a closed correlation with the ratio of apoptosis,but occurred earlier than the latter.ConclusionApoptosis may be involved in the process of acute gastric mucosa injury.As an important impaired factor,oxidative stress may lead to the formation of apoptosis.
Key wordsoxygen free radicalapoptosisstress ulcerpathogenesis
应激性溃疡(stress ulcer,SU)的发病机制尚未完全阐明。目前认为胃黏膜微循环障碍造成黏膜缺血、缺氧是重要的发病环节。氧化应激是机体遭受应激后的重要反应。正常胃黏膜细胞存在凋亡，与细胞增殖共同调节胃黏膜结构和功能的稳态，细胞凋亡和增殖之间的失衡是胃溃疡发生的因素［1］。但其是否在应激性溃疡中存在并发挥作用，以及氧化应激与细胞凋亡之间是否存在相关性，目前尚未知。
1材料与方法
1.1实验动物及分组40只雄性Wistar大鼠，体重220～280g，随机分为5组：正常对照组和应激后3、6、12、24h组，每组8只。应激组采用改良Allen法［2］建立颅脑损伤模型。
1.2溃疡指数(UI)按Guth标准［3］评定。
1.3胃黏膜SOD、MDA测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，刮取胃后壁黏膜制备组织匀浆，严格按说明书操作。
1.4电镜超微结构经多聚甲醛灌注固定后，取大弯侧胃前壁组织，送透射电镜观察。
1.5早期细胞凋亡检测AV-PI(磷脂酰丝氨酸结合蛋白联合碘化丙啶双标记)试剂盒由BD pharmgen公司提供。刮取剩余胃前壁黏膜制备单细胞悬液，流式细胞仪采样，BD软件计算机分析，计数早期凋亡细胞率。
1.6统计学分析各组实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 11.0软件进行t检验及数据间相关分析。
2实验结果
2.1胃黏膜大体及UI变化应激后3h胃黏膜偶见轻度充血，UI=0。6h见轻度充血、水肿，少量点状糜烂，UI=3.88±1.27。12h见明显充血，点线状糜烂和新鲜出血灶，UI=12.13±2.96。24h见点线状糜烂、剥脱、小溃疡形成，UI＝32.75±8.41。应激后6、12、24h与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。
2.2透射电镜超微结构变化应激后3h见线粒体嵴轻度肿胀，微绒毛稍多。6h组细胞缩小，核染色质固缩聚集成新月体形的凋亡细胞，胞膜起泡出芽，形成小体及吞噬现象。12h组见大量凋亡细胞。核膜皱褶，细胞器集中，微绒毛消失。尚有部分细胞死亡。24h组死亡细胞增多。线粒体高度肿胀；粗面内质网广泛扩张、脱颗粒。
2.3胃黏膜SOD、MDA变化胃黏膜SOD活性于应激后3h显著降低，12h达低谷。MDA含量于应激后3h显著升高，6h达高峰。见表1。
表1各组胃黏膜SOD、MDA变化(略)
注：为该组与对照组比较P＜0.05，ac为相应组间比较，P＞0.05
2.4早期细胞凋亡率检测应激后3h早期细胞凋亡稍增，但与对照组差异无显著性。应激后6h显著增多(P＜0.05)，于12h达高峰。应激后24h早期凋亡细胞已明显减少，较应激后12h差异有显著性(P＜0.05)，但仍明显高于对照组(P＜0.05)。见表2。
表2各组早期细胞凋亡百分率变化(略)
注：为该组与对照组比较，P＜0.05，ab为相应组间比较，P＜0.05
2.5SOD、MDA与细胞凋亡相关分析应激后SOD活性与早期细胞凋亡率呈显著负相关(r＝-0.713，P＜0.05)，MDA与早期细胞凋亡率呈显著正相关(r＝0.684，P＜0.05)。
3讨论
本实验观察了应激反应前后大鼠胃黏膜变化，同时检测了氧化应激相关指标SOD和MDA，其消长与黏膜损害程度一致，且开始出现显著性变化的时间早于形态学改变，提示氧化应激是应激性胃黏膜病变的重要损害因素。
本实验还观察到应激后6h胃黏膜损伤尚不明显，而细胞凋亡已显著增多，并于12h达高峰。应激后24h黏膜明显糜烂、出血和溃疡形成，细胞凋亡却已显著减少，坏死细胞增多，提示细胞凋亡在应激性胃黏膜损害早期明显增加，其参与应激性溃疡形成。应激时，全身神经、体液、激素水平和局部细胞内环境发生变化：内脏血流灌注减少，胃黏膜缺血缺氧，局部微循环障碍，黏膜pH值和通透性改变，细胞内Ca2+浓度升高，可能是导致黏膜上皮细胞凋亡增加的重要机制。同时，胃蠕动减缓，细菌黏附并穿过上皮屏障，引起炎症反应及细胞因子的产生［4］。炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)均可增加体内外细胞的凋亡［5，6］，生长因子的缺乏、细菌毒素及缺血-再灌注损伤均可导致大鼠上皮细胞凋亡增加，同时伴有黏膜屏障功能障碍，且通透性与凋亡指数呈正相关［7，8］。可见，黏膜上皮细胞凋亡的增加与黏膜屏障功能受损有关。因而推测，细胞凋亡增加，分化增殖能力下降，不能产生大量新分化细胞及时补充，凋亡速度大于增殖速度；如果损伤性刺激持续存在并达到相当程度，触发基因调节失控，大量坏死，最终导致黏膜损害和溃疡形成。
实验中应激后胃黏膜SOD活性进行性下降，MDA升高，表明氧自由基产生增加。相关分析显示SOD和MDA均与胃黏膜细胞凋亡率呈显著相关，且在时间上早于细胞凋亡的发生，提示应激后氧自由基增加是导致胃黏膜细胞凋亡发生的重要原因之一。氧自由基诱导细胞凋亡的机制尚不清楚，可能为：氧自由基直接损伤DNA，导致聚ADP核糖转移酶活化和p53积累；脂质过氧化物使细胞内Ca2+水平增加；通过介导线粒体依赖途径，使线粒体孔通透性改变、线粒体膜去极化，激活半胱氨酸蛋白水解酶(caspases)家族；氧自由基可引起转录因子激活物NF-κB和抑制蛋白(IκB)的解离，激活NF-κB与DNA的结合活性，影响相关基因的转录，改变细胞的表形特征从而诱导细胞凋亡［9］；氧自由基作用于细胞膜，诱发脂质过氧化，从而影响细胞的信号传递系统，激发有关的调控基因；调控肿瘤坏死因子(TNF-α)等细胞因子共同参与等。但如何启动、引发哪些相关基因调控胃黏膜细胞凋亡，值得进一步探讨。
参考文献
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(编辑 子善)
作者单位： 100050 首都医科大学附属北京天坛医院消化内科