急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究

　　［摘要］  目的  检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病(MRD)，同时分析其对预后判断的指导价值。方法  建立逆转录PCR(RT/PCR)用以检测APL患者PML/RARα。结果  RT-PCR方法敏感而可重复。治疗前APL患者的RT-PCR阳性率为92.8%(39/42),而维甲酸或化疗诱导完全缓解后MRD阳性率为56.7%(21/37)。另外，MRD阳性与缓解后APL患者的复发有关，并可以作为缓解后预测APL患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。结论  RT-PCR能够检测APL患者的MRD和作为预测复发的指标。
   
　　［关键词］  急性早幼粒细胞白血病；微小残留病；RT/PCR
   
　　白血病患者完全缓解（CR）后的微小残留病（MRD）已被证实与复发有关［1］。MRD的检测也成为指导缓解后进一步化疗的重要指标［2］。在目前血液病的应用实践中，MRD检测的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法检测慢性粒细胞白血病（CML）的BCR-ABL融合基因［3］。

　　急性早幼粒细胞性白血病（APL）以特异的染色体t（15;17）（q22;q21）易位为特征［4］。最近，许多实验室发现t（15;17）易位后，通过15染色体上的PML基因和17染色体上的RARα基因并列而导致融合基因PML/RARα形成［5］。根据PML断裂点的位置不同，可以产生2个主要的PML/RARα异构体。断裂点位于PML内含子3或4（bcr3），则PML外显子3（P3）和RARα外显子3（r3）之间形成短（S）型融合mRNA产物，而断裂点位于PML内含子6（bcr1）或下游，PML内含子6（P6）和RARα外显子（r3）形成长（L）型融合体［6，7］。RT-PCR法的建立正是依赖于断裂点的位置而设计适当寡核苷酸引物，继而扩增PML/RARαmRNA异构体［8］。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的检测成为可能，并可在APL患者临床缓解期时早期预测白血病的复发。

　　1  资料与方法

　　1.1  病例选择  本研究中的42例患者均为1993～2000年发病，男26例，女16例，年龄12～72岁，根据FAB标准［9］诊断为APL。全部病例均经全反式维甲酸（ATRA）治疗［30～60mg/（m2·d）］诱导缓解。巩固化疗方案为标准的HOAP或DA方案。巩固治疗后处于缓解期的患者采用全国维甲酸协作治疗组建议的ATRA与化疗联合治疗方案维持治疗［10］。骨髓单个核细胞用Ficoll分离并保存于液氮中。

　　1.2  RNA提取  10ml淋巴细胞分离液加于试管中，然后2ml骨髓细胞缓慢加入试管中，离心4000r/min 20min。取单个核细胞移入另一试管中，再用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs［11］。提取时注意避免样品间的交叉污染。

　　1.3  筑巢式RT-PCR检测  APL的PML/RARα检测方法：8个寡核苷酸引物用于逆转录、扩增，检测其长或短型异构体。

　　逆转录引物：A 5-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3

　　PML/RARα引物：B 5-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3  C 5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3  D 5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3  E 5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3  F 5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3  G 5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3  H 5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3

　　正常RARα转录引物：I 5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-3  J 5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3  K 5-GACCACTCTCCAGCACCA-3  L 5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAACT-3

　　RT-PCR方法与步骤按照早期报道的方法进行［12］。

　　1.4  PCR产物分析  取10μl第2轮PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭1μg/ml染色，照相。并移至尼龙膜上，用5末端寡核苷酸探针（H）杂交，放射自显影30min，拍片。

　　1.5  统计学方法  采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  PCR产物的结果及其敏感度  PML/RARα的L、S异构型（见图1）。RT-PCR的敏感度为2.5×10-6。

　　图1  PML/RARα类型（略）

　　2.2  RT-PCR阳性百分率  用全反式维甲酸治疗前APL患者PML/RARα的检测，34例为L型阳性，5例为S型阳性。L型、S型或2型的总阳性百分率分别为80.9%（34/42）、11.9%（5/42）和92.8%（39/42）。APL患者CR后的MRD阳性率是56.7%（21/37）。见表1。

　　表1  APL患者RT—PCR检测阳性率的变化（略）

　　注：*2 cases with APL not getting CR

　　2.3  APL患者MRD的变化  缓解不同时期的APL患者MRD的变化（见图2）。结果显示：CR后MRD百分率降低，5～7年MRD百分率比缓解后低（P<0.05）。另外，长期CR的7例中有5例生存超过7年，并且持续MRD阴性。

　　图2  CR时间与MRD变化关系（略）

　　2.4  复发与MRD之间的关系  见表2。结果显示，在2年和3年内，MRD阴性的APL患者复发百分率低于MRD阳性APL患者的复发百分率（P<0.05）。缓解2年和3年内，MRD阴性患者第一次复发的平均时间（月）低于MRD阳性患者（P<0.05）。

　　表2  MRD阳性和MRD阴性患者复发百分率和复发时间变化（略）

　　P-S:survival percent of the MRD positive    P-F: disease-free survival percent of the MRD positive

　　N-S:survival percent of the MRD negativeN-F:disease-free survival percent of the MRD negative

　　图3  MRD阳性和MRD阴性患者无病生存率和存活百分率比较（略）

　　2.5  MRD检测对治疗的指导意义  APL患者CR后MRD检测的意义在于指导此病的治疗，尤其是当MRD阴性转为MRD阳性时。CR后7例MRD阴性转为MRD阳性时给予巩固化疗。7例中有4例再一次转阴。他们均无病状态存活超过5年。另有3例存活3年无复发。相反，4例转为阳性无巩固治疗的MRD检测3～16个月复发。其中2例没有获得第2次缓解而死亡。

　　2.6  无病生存率与存活百分率  MRD阳性和MRD阴性患者持续无病存活百分率和总的存活率（见图3）。结果显示，第一次CR后1或2年时2组之间的无病生存率或总的存活率差异无显著性（P>0.05）。随访3或5年，MRD阴性患者的无病生存率均明显高于MRD阳性患者（P<0.05）。3年时的2组存活率差异无显著性（P>0.05），而5年时两组的存活率差异有显著性（P<0.05）。

　　3  讨论

　　已经证实ATRA可以有效地诱导APL患者取得完全缓解［10，13］。根据本研究结果和其他报道材料，患者伴有t（15;17）或PML/RARαRT-PCR阳性的APL患者约95%以上对于足够疗程的ATRA有效。然而，单独应用ATRA作为缓解后的治疗，大多数患者在6个月内复发［14］。说明尽管ATRA在临床上可以有效地诱导APL患者完全缓解，但在大多数患者中它不能充分消除白血病细胞克隆。因为APL患者复发的原因之一是由于MRD的存在，因此CR后应该采用化疗与ATRA治疗相结合，以消除MRD和预防复发。

　　尽管化疗或ATRA能诱导APL患者的临床缓解，但少量的恶性细胞仍在体内存留或成为MRD状态。MRD是白血病复发的最重要的原因。但它很难通过外周血的常规形态学检测到，而只能通过特异和敏感的PCR或RT-PCR方法检测到。在目前的研究中，RT-PCR检测APL中的MRD是有应用价值的。因为其敏感度是2.5×10-6，它足以检测MRD。此与其他报道结果相似［15］。用建立的RT-PCR方法进行PML/RARα融合基因检测，即用于检测APL缓解后的MRD。结果显示，初诊时L型异构体、S型异构体或总异构体阳性百分率分别是80.9%（34/42），11.9%（5/42）和92.8%（39/42）。而APL患者CR后MRD阳性率为56.7%（21/37）。MRD百分率低于其他报道［15］。可能与敏感度大小或选择的不同病例有关。

　　2年和3年内，APL患者MRD阴性的复发率低于MRD阳性者（P<0.05），而MRD阳性患者缓解后第一次复发的平均时间（月）低于其阴性者（P<0.05）。因此，提示MRD阳性患者易复发［16］，MRD检测可作为预测复发的指标。另外，MRD百分率随着CR后的时间延长而减低。如5年和7年MRD百分率明显低于初次CR后的相应MRD百分率（P<0.05）。以往未见类似现象的报道。另一方面，7例长期CR超过7年的患者中，有5例持续MRD阴性。

　　APL缓解后检测MRD的意义在于指导此病的治疗。尤其当MRD阴性转为阳性时。本研究中7例缓解后患者从MRD阴性转为阳性，在给予巩固治疗后，有4例再一次转阴，并在无病状态下存活超过5年。另有3例也存活3年无复发。相反，有4例MRD转为阳性者没有给予巩固治疗，在MRD检出后的3～16个月内复发，其中2例没有得到第2次缓解而死亡。根据目前研究结果，MRD阳性，尤其是由阴性转为阳性者，可以指导临床工作者采取进一步治疗措施（如巩固治疗），以尽可能早的消除MRD，并获得长期缓解。

　　另外，在第一次CR后的1～2年内，MRD阴性和阳性2组之间的存活百分率或无病生存率差异无显著性（P>0.05）。但在3和5年时，2组间的无病生存率差异有显著性，MRD阳性者低于其阴性者（P<0.05）。至于存活百分率方面，3年时2组之间无明显差别，5年时差异明显。因此，此结果进一步说明RT-PCR检测MRD能预告APL复发。与陈竺等［15］的报道结果一致。但是，后者比我们观察的时间短。

　　总之，在APL缓解期经ATRA或巩固治疗后MRD阳性者有可能复发。据此我们建议APL患者CR后最好应用RT-PCR连续检测MRD，当缓解期MRD阳性时，及时给予治疗（巩固化疗，ATRA或亚砷酸治疗）。

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　　（编辑：江  枫）

　　作者单位： 250062 山东济南，山东省医学科学院血液肿瘤学研究室

　　250014 山东济南，山东省千佛山医院血液科

　　250012 山东济南，山东大学齐鲁医院血液肿瘤中心