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［摘要］ 目的 建立拟血管性痴呆（VD）的动物模型，探讨针刺百会及大椎对VD大鼠的认知行为及脑内一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）的影响。
方法 选用纯系Wistar老年大鼠36只，随机分为假手术组、模型组、针刺组和西药组，采用2-血管阻断法（2-VO）制作VD大鼠模型，之后进行百会、大椎针刺治疗。检测大鼠穿梭箱实验成绩及脑内NO的含量及NOS的活力。结果 数据经统计学分析表明，针刺VD大鼠的百会、大椎穴，可明显减少VD大鼠在穿梭箱实验中的电击次数和电击时间，降低脑组织内NO的含量及NOS活性。结论 针刺百会、大椎能提高VD大鼠的学习记忆能力，改善自由基代谢，促进VD大鼠的智能恢复。
［关键词］ 针刺疗法；痴呆/血管性；一氧化氮；一氧化氮合酶
Effect of Baihui(DV 20)，Dazhui(DV 14) acupuncture on the NO content and the NOS activity of vascular dementia model rats
CHENG Wei-ping,Toshihide Harada,CHEN Yi,et al.The First Hospital Attached to Heilongjiang University of TCM 150040,China
［Abstract］ Objective To establish an animal model of vascular dementia(VD) in aging rat and study the effect of Baihui,Dazhui acupuncture on the NO content and the NOS activity of VD model rats. Methods Select 36 pure Wistar aging rats which were divided into model group,acupuncture group,medicine group,negative injury group.In the experiment we adopted 2-VO to duplicate model VD and carried on acupuncture treatment on Baihui-dazhui of rat heads.Then we examine the memory ability of rats in accordance to the shuttle test,the content of NO and the activity of NOS in brains. Results Modelling led to the reduction of model animal’s learning and memory ability.After the acupuncture treatment,the statistic data showed this method could decrease stroke times and time of shuttle rats,decrease the content of NO and the activities of NOS. Conclusion Baihui,Dazhui acupuncture could increase the learning and memory ability of model animal,improve the metabolism of free radical and promote the restoring intelligence of VD rats.
［Key words］ acupuncture;dementia,vascular;NO;NOS
血管性痴呆（VD）是因血管疾病所致的智能及认知功能障碍的临床综合征［1］。国际研究表明，随着年龄的增长，VD的发病率呈指数上升［2］，严重威胁着老年人的健康和生存质量，已成为国内外医学界的又一研究热点。临床观察表明：针刺百会、大椎等穴治疗VD疗效较好，为了进一步探讨针刺治疗VD的机制，我们建立了VD模型大鼠进行针刺治疗，并检测了VD大鼠的穿梭箱实验成绩和生化酶学的改变。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 选用纯系健康Wistar雄性大鼠36只，月龄18～20个月，体重（500±20）g，由黑龙江中医药大学实验
动物中心提供。
1.1.2 仪器 电热恒温水浴箱（RF-540型，江苏）；电动离心机（LD5-2型，北京）；电动玻璃匀浆机（DY89-1型，宁波）；分析振荡器（FZQ-2型，江苏）；托盘式扭力天平（TN-100B型，上海）；大鼠程控穿梭箱（DCS-2型，中国医学科学院药物研究所）；722光栅分光光度计（上海第二分析仪器厂）。
1.1.3 试剂 NO及NOS试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 VD模型的建立 采用改进的拟血管性痴呆的造模型方法［3］，将36只大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组及西药组。术前12 h禁食水。以10%乌拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉后，消毒，颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉及神经，随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA，10 min后，再通10 min，再夹闭10 min，首次夹闭前给予腹腔注射硝普钠2.5 mg/kg。再通后缝合伤口，放回笼中保温饲养，每只肌注青霉素20万u，连续5天，以防感染。假手术组仅分离双侧颈总动脉后缝合。
1.2.2 实验方法 术后7天，伤口完全愈合，饮食正常后给予治疗。针刺组取百会、大椎穴（取穴参照林文注等编著的《实验针灸学》），30号0.5寸毫针刺入，持续捻转5 min，而后留针30 min，每日1次，连续治疗30天。药物组给予浓度为40 mg/ml的脑复康水溶液，每日1次灌胃，剂量为6 ml/kg，共治疗30天。其余两组给予等量生理盐水灌胃。
1.2.3 行为学测试方法 术前及术后分别进行行为学检测，将大鼠放入穿梭箱内，适应3 min后打开电源，蜂鸣后穿梭箱底部一侧通电，大鼠被电击至另一侧（被动逃避）。如此反复，大鼠听到鸣笛后即从电流区域逃到无电区域（主动逃避），记录电击次数和电击时间。
1.2.4 NO及NOS的检测 行为学测试后，将大鼠断头取一侧脑组织，冰生理盐水冲洗后，称重匀浆，按照试剂盒说明，检测NO的含量及NOS的活性。
1.2.5 统计学方法 采用t检验，判断均数的差异显著性。数据用均数±标准差（x±s）表示。
2 结果
2.1 行为学检测结果 见表1。 表1 各组大鼠穿梭箱实验各项指标的比较由表1可见，各组数据经统计学分析表明：各组术前（治疗前）数据、电击次数、电击时间比较（P>0.05），测试比较无差异。手术前后数据比较，模型组之间比较（P<0.001），差异有极显著性。手术后（治疗后）针刺组与西药组比较（P>0.05），差异无显著性。针刺组和西药组与模型组比较（P<0.01），差异有非常显著性。模型组与假手术组比较（P<0.05），差异有显著性。
2.2 NO及NOS检测结果 见表2。表2 各组大鼠术后（治疗后）脑组织NO含量和NOS活性比较 注：*P<0.001，△P<0.05，▲P>0.05由表2可见，各组数据经统计学分析表明：模型组与假手术组比较，NO含量与NOS活性明显升高（P<0.001），差异有极显著性，提示造模成功。针刺组、西药组与模型组比较，NO含量与NOS活性明显降低（P<0.05），差异有显著性，提示两种治疗方法均有效。针刺组和西药组之间比较（P>0.05），提示两种治疗方法差异无显著性。
3 讨论
3.1 针刺百会、大椎能提高VD大鼠的学习记忆能力 VD属于中医学“呆病”、“文痴”范畴，针灸单穴及复方治疗在古代文献已有记载。据临床验证，针灸疗法对VD有肯定的治疗效果。《难经·二十八难》云：“督脉者……上致风府，入属于脑”。百会与大椎均为督脉穴位，督脉与脑密切相关，百会为“三阳五会”，大椎为“诸阳之会”，针刺此二穴可以激发经气，疏通经络，使脑髓得气血之荣养而复聪［4］。周莉等［5］亦观察到针刺百会可提高人的即时记忆能力及小鼠的学习成绩和记忆再现能力。此次实验中穿梭箱的行为学测试结果表明，针刺百会、大椎可缩短大鼠的电击次数和时间，提高VD大鼠的学习记忆能力。
3.2 针刺百会、大椎可改善VD大鼠脑内的自由基代谢 VD是我国最常见的老年期痴呆类型，系由脑血管因素引起的脑循环障碍、脑组织受损导致的一种认知功能缺损的综合征［6］。基础研究中，认为反复性脑缺血是VD的主要病因之一［7，8］，而自由基对细胞及细胞膜上不饱和脂肪酸的破坏和过氧化是脑缺氧后神经细胞损害的重要发病因素。
NO是一种难溶于水的脂溶性的气体，因为它的分子结构中具有不配对电子，所以它也是一种自由基。NO不仅参与正常生理过程中的长时程增强和长时程抑制、学习记忆，而且与脑缺血、缺氧等病理生理状态密切相关。最近有实验证实，海马内NO的表达与学习记忆密切相关［9］，推测NO在血管性痴呆导致学习记忆障碍过程中发挥作用，较多的研究认为NO的神经毒性作用主要在缺血的晚期。何玲［10］发现老龄组大鼠海马CA1区nNOS均较幼年和成年组表达水平降低，提示老龄期nNOS表达的下降可能是导致学习记忆能力下降的原因之一。张雪朝［11］以免疫组化法探讨海马神经型NO与VD大鼠的关系。发现大鼠全脑反复缺血2周后即出现明显的空间分辨学习记忆障碍，同时海马CA1区神经型NOS免疫阳性细胞明显增加，表明海马内NO的持续生成和释放，提示神经型NOS不仅参与缺血性脑损伤，而且在痴呆形成的过程中可能发挥重要作用。且有临床研究观察到，血管性痴呆病人脑脊液中NO浓度明显增高，与痴呆程度呈正相关［12］。Vincent等学者的实验发现，神经型NOS的激活可作为一个重要介导因素引起神经元的毒性作用，引起神经元的凋亡或细胞的变性坏死［13］。而NOS的激活必然导致NO的增加。
本实验显示，VD模型组大鼠脑内NO的含量和NOS活力明显增加，并通过穿梭箱实验证实记忆亦出现明显受损。由于VD大鼠学习记忆障碍与NO的含量呈正相关，亦提示学习记忆障碍与脑内NO水平过高而导致神经元的凋亡或坏死有关。本实验还显示，针刺百会、大椎对VD大鼠学习记忆有明显改善，同时NOS活力明显降低，NO的合成减少，提示针刺具有清除自由基的功效，可降低血清脂质过氧化物的水平，阻断脂质过氧化反应［14］。其对VD大鼠学习记忆障碍的改善，可能是通过抑制nNOS的过多合成，从而阻止NO对海马神经元毒性作用。根据以上实验机制可以推测针刺不仅使VD大鼠脑内合成NO趋向于平衡，调节脑血流，改善脑部供血、供氧，减轻脑水肿，而且抑制脑缺血引起的自由基反应，恢复细胞内氧化/抗氧化平衡，减轻膜脂质过氧化，减少缺血后细胞内Ca2+超载，保护神经元，从而改善了VD大鼠的智能状态。
［参考文献］
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10 何玲.急性低压缺氧对大鼠海马CA1区nNOS表达的影响.第四军医大学学报,2003,24(2):166-168.
11 张雪朝.血管性痴呆大鼠记忆障碍与海马神经型一氧化氮合酶表达的关系.解剖学杂志,2001,24(4):340-342.
12 Tohg H,Abe T,Yamazaki K,et al.The cerebrospinal fluid oxidized NO metabolites nitric and nitrate in Alzheimer’s disease and vascular dementia of Binswanger type and multiple small infarct type.J Neural Transm,1998,105:1283.
13 Vincent AM,Maiese K.Nitric oxide induction of neuronal endonuclease activity in programmed cell death.Exp Cell Res,1999,246:240.
14 贾健平,贾健民.鼠脑缺血再灌流动物模型和病理学研究进展.中风与神经疾病杂志,1992,9(1):62-64.
*基金项目：本课题为黑龙江省海外学人资助项目（编号：10S4HQ021）
作者单位： 1 150040 黑龙江哈尔滨，黑龙江中医药大学附属一院神经内科
2 日本广岛，广岛大学医学部脑神经内科
(编辑：丁剑辉)