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【摘要】 目的 探讨经K562细胞裂解物冲击致敏的外周血单个核细胞衍生的树突状细胞（DC）的生物特性及体外诱导抗原特异性CTL应答的能力。方法 采集健康人抗凝外周血分离单个核细胞，贴壁细胞用含rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α的RPM1640+10%FBS培养基体外诱导培养产生DC，5天收获细胞并将细胞分组：A组：未负载抗原DC；B组：加入K562细胞裂解液脉冲DC。7天后用流式细胞仪检测成熟DC免疫表型，并将非贴壁细胞（淋巴细胞）作为效应细胞与各组DC共育，以产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。12天用LDH释放试验测定对K562细胞的杀伤活性。并用ELISA方法测定细胞上清液中IL-12的含量。结果 （1）经细胞因子联合体外诱导的各组DC较培养前在数量，形态及免疫表型上差异有统计学意义，CD86、CD83、CD40、CD1a表达增加，其中经K562细胞裂解液冲击的DC的CD83 CD86表达率明显升高。（2）效应细胞与K562细胞混合培养时，负载K562细胞裂解液的DC刺激后的T细胞比单独DC刺激后的T细胞对K562细胞的杀伤作用更明显。（3）负载K562细胞裂解液的DC细胞培养上清液中产生IL-12含量较未负载抗原的DC明显增加。结论 用GM-CSF、IL-4以及TNF-α诱导培养健康人外周血单个核细胞可以得到成熟的DC，且经K562细胞裂解液致敏可以进一步促进DC的成熟并体外诱导特异性杀伤靶细胞的CTL。
【关键词】 白血病；树突状细胞；冻融抗原
Anti-leukemia activity of T cell activated by antigen loading dendritic cells
YANG Lei，LIU Fu-qiang，WANG Jing-wen，et al.Department of Hematology，Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100730，China
［Abstract］ Objective To explore the quantity，morphology and immunophenotype of dendrictic cells co-cultivated with cytokines from peripheral blood mononuclear cells.To investigate the effects of dendrictic cells pulsed with K562 cells frozen-thawed antigen on inducing the cytotoxic T lymphocyte (CTL) to get specific anti-tumor activity in vitro.Methods Isolating peripheral blood mononuclear cells from healthy donor，adherent cells were cultured in RPM1640 medium contained 20% FBS which were supplied with rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α.After 5 days，the DCs were harvested and divided into 2 groups:DCs were cultured alone(group A);DCs were pulsed by lysed K562 (group B).On 7days DCs were mixed cultured with autologous T cells for generation of a specific CTL and their quantity，morphology and immunophenotype were detected.On 12 day cyotoxicity was determined with LDH release.Results (1)It was found that the DC were demonstrated to have the characteristic morphology and ultra-structures of dendritic cells，expressing the DC-associated antigens such as CD86，CD83，CD40，CD1a.and especially in DCs pulsed by lysed K562 cells frozen-thawed antigen.(2)The CTL induced by DC pulsed with lysed K562 cells frozen-thawed antigen were effective for killing target cells as compared with the CTL induced by DC simply，T cell simply.(3)Meanwhile it could secrete more cytokine IL-12 than DC simply.Conclusion Dendritic cells could be successfully generated from peripheral blood mononuclear cells by RPM1640 medium contained 20% FBS which were supplied with rhGM-CSF，rhIL-4，TNF-α.DC loaded with lysed K562 cells frozen-thawed antigen K562 could stimulate specific CTL responses against leukemia cells.
［Key words］ leukemia;dendritic cell;frozen-thawed antigen
目前，随着抗肿瘤药物的研发进展，化疗可以使70%～80%的新发急性髓系白血病（AML）患者获得完全的血液学缓解，而其中的50%～70%终因存在微小残留病（MRD）而导致复发［1］。长期生存率很低，5年生存率不足20%。所以，白血病高复发率是困扰临床血液工作者的一个难题，残留的白血病细胞被认为是引起白血病复发及影响预后的根本原因。应用免疫治疗有效的抑制和去除微小残留病（MRD）就成为现阶段研究的重要方向。
树突状细胞（dendritic cell，DC），是一种免疫功能最强的专职抗原递呈细胞(APC)。外周的DC在迁移过程中逐渐成熟，表达丰富的主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ、Ⅱ类分子，共刺激分子（CD80、CD86等）、黏附分子(CD1a、CD83等)和TH1型应答主导因子IL-12，在体内外均能激发T细胞增殖，诱导特异性CTL生成，同时它是唯一能刺激初次T细胞应答的APC，在免疫应答的诱导中占据独特的地位。
如何使白血病DC有效地递呈白血病细胞抗原是白血病免疫治疗的关键。国内外已经开始实验研究应用细胞因子体外诱导DC，制作DC瘤苗，尤其是负载抗原的瘤苗，能快速将抗原递呈给T细胞，诱导特异性CTL，杀伤肿瘤细胞。本试验研究将负载K562细胞裂解液脉冲DC以观察其是否可以促进DC的成熟，增加细胞毒T淋巴细胞活性从而杀伤微量残存的白血病细胞，达到提高疗效，进一步延长缓解期的效果。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）均购于中国协和医科大学基础医学部细胞中心。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素-4（rhIL-4）、重组人白细胞介素-2（rhIL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）均购于PEPROTECH公司。荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD1a-FITC、CD4-PE0、CD80-FITC、CD83-PE购于BD公司。CytoTox96非放射性细胞毒分析试剂盒为PROMEGA公司生产。IL-12试剂盒为DICLONE公司产品。正常人外周血源自10例健康志愿者。K562细胞系来自本实验室液氮保存。流式细胞仪为美国BD公司产品。
1.2 K562细胞裂解液的制备 参照文献［2］，K562细胞解冻后传代培养，取生长较好的用于实验。将细胞（1×106/ml）在-80 ℃中反复冻融6次，离心取上清经滤过膜除菌，即为K562细胞冻融裂解液。
1.3 DCs的培养 （1）单个核细胞的制备：取健康人抗凝外周血40 ml，PBS稀释后用人淋巴细胞分层液离心分离单个核细胞（PBMNC），并用1640液重悬，调整细胞浓度为4×106/ml，放置于37°C、5%CO2温箱中孵育2 h［3］。（2）非贴壁细胞的收集：收集非贴壁细胞为效应细胞，其中部分细胞作流式检测T细胞的比例，其余冻存备用。（3）DCs的培养（贴壁细胞）：保留贴壁细胞，加入含10%的胎牛血清的1640完全培养基，rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 10 ng/ml，37 ℃、5% CO2温箱中孵育，第4天全量换液并补充相应的细胞因子。第4天将DCs分成2组，每组设3个复孔。A组仅DCs+TNF-α 50 ng/ml。B组DCs+K562细胞冻融液0.5 ml（2×105个K562细胞制成的冻融液/孔；按DC∶K562=1∶1）+TNF-α 50 ng/ml。（4）倒置相差显微镜下每天观察细胞生长情况，第7天使用吸管吹吸，轻微黏附的细胞脱落收集每组部分培养孔内的悬浮及半悬浮细胞作细胞免疫表型检测。
1.4 DCs的收集和鉴定 将获得的DCs用PBS洗两次，调整细胞浓度为1×106/ml，加入流式细胞分析专用管，分别加入抗CD1a-FITC、CD80-FITC、CD4-PE0、CD83-PE单克隆抗体各10 μl上机检测，使用同型IgG抗体作阴性对照。
1.5 效应细胞的制备和体外诱导CTL 第5天复苏冻存的效应细胞，用1640培养液接种于培养瓶中，同时加IL-2（100 u/ml）37 ℃、5% CO2温箱中共培养。第7天收集，按不同的刺激物分3组：A组单加IL-2(100 u/ml)继续培养，即T细胞+ IL-2组；B组加IL-2和未用K562细胞冻融液冲击的DCs（T与DCs的比值为5∶1），即T细胞+ IL-2+DCs组；C组为加IL-2和K562细胞冻融液冲击的DCs（T与DCs的比值为5∶1），即T细胞+ IL-2+ACL-DCs组。均于第9天用含IL-2的培养液半量换液，第11天用不加IL-2的培养液半量换液，第14天收集的细胞作为效应细胞。
1.6 CTL活性检测 K562细胞解冻后传代培养，取生长较好的细胞（台盼蓝染色判断细胞活性）用于实验，为靶细胞。应用CytoTox96细胞毒分析试剂盒，采用LDH法测定。按效/靶比（E/T）为5∶1、10∶1、25∶1混合培养于96孔板中。另设靶细胞自然释放，靶细胞最大释放，效应细胞自然释放孔，每孔设3个复孔，37 ℃、5% CO2温箱中孵育4 h后吸取上清，在酶标仪波长为490 nm下读取A值。CTL的活性（%）=（实验组-靶细胞自然释放-效应细胞自然释放/靶细胞最大释放-靶细胞自然释放）×100%。
1.7 细胞培养上清液IL-12含量测定 取第14天细胞培养上清，按照IL-12，ELISA试剂盒操作要求依次加样、孵育、洗涤、酶标仪比色。
1.8 统计学方法 所有数据以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS 10.0统计软件，采用双因素方差分析进行统计学分析。
2 结果
2.1 树突状细胞的数量、形态与表型分析 （1）培养后第2～3天细胞开始变形，拉长呈梭形、细树枝状、放射状等不规则形态，少数细胞开始悬浮生长。但大部分仍贴壁生长，可见部分聚集成团。第5～6天后，集落明显增多，且有更多的细胞呈轻贴壁状态；第9～10天后，细胞的胞体进一步增大，更多的细胞呈现悬浮生长，倒置显微镜下可观察到大量具有毛刺状突起的细胞，第14天时细胞具有典型的树突状细胞形态，尤其用K562细胞冻融液冲击的DCs组形成的集落数量增加，且悬浮细胞比例增加。（2）流式细胞仪检测免疫表型变化：结果提示，经过细胞因子联合体外诱导的DC，均表达CD1a、CD40、CD83、CD86，并与培养前PBMC的表达率差异有统计学意义，P值均＜0.001。同时应用K562细胞冻融液冲击的DCs组（ACL-DCs），CD86、CD83表达率较未负载DCs组升高（P＜0.01），说明经K562细胞冻融液冲击后可以促进DC的成熟，使黏附分子及共刺激分子高表达。见表1。表1 培养前后及不同诱导方法DCs免疫表型结果注：（1）A组：未负载DCs；B组：K562细胞冻融液冲击的DCs组（ACL-DCs）。（2）与培养前MNC比较，▲P＜0.01；与A组比较，★P＜0.01：
2.2 CTL活性检测 不同效/靶比（E/T）分别为5∶1、10∶1、25∶1与K562细胞（靶细胞）混合培养，采用LDH法测定OD值并计算T淋巴细胞杀伤率。见表2。 表2 不同效靶比时各观察组刺激的T细胞对K562细胞杀伤活性 注：（1）A组：T细胞组；B组：DCs+T细胞组；C组：ACL-DCs+T细胞组。（2）与A组比较，*P＜0.01；与B组比较，▲P＜0.01
2.3 不同效靶比CTL活性 见图1。图1 不同效靶比CTL活性 计算不同效靶比时（E∶T=5∶1、10∶1、25∶1）各观察组的T细胞对K562细胞的平均杀伤率±标准差，从图1可以看出，各组杀伤率均是随着效靶比的增大而增大，E∶T=25∶1时T细胞对K562细胞的杀伤作用最大。T细胞组、DCs+T细胞组、ACL-DCs+T细胞组对K562细胞的杀伤百分比分别为（5.9±2.4）%、（15.3±2.3）%、（28.2±4.5）%。经冻融抗原负载DCs组激活的CTL对K562细胞杀伤活性显著高于其他各组（P＜0.01）：提示经冻融抗原负载后的DC刺激T细胞能力增强，并有较强的杀伤K562细胞的活性，可以产生有效的CTL。
2.4 细胞培养上清液IL-12含量测定 取第14天细胞培养上清按照IL-12ELISA试剂盒操作要求测得结果见表3。表3 细胞培养上清液IL-12分别测定结果 注：（1）A组：T细胞组；B组：DCs+T细胞组；C组:ACL-DCs+T细胞组。（2）与A组比较，*P＜0.01；与B组比较，▲P＜0.01
结果提示：ACL-DCss+T细胞组细胞上清中IL-12的含量达（322.98±53.5）pg/ml明显升高，较其他各组差异有统计学意义，P＜0.001。说明，经过K562冻融抗原致敏，体外诱导的DC更加成熟，分泌IL-12明显增多。
3 讨论
树突状细胞（DC）是迄今为止功能最强专职抗原递呈细胞（APC），可激活初始型及静息型T淋巴的细胞，被认为是免疫反应的始动者。DC通过巨胞饮、受体介导的内吞及吞噬三种方式摄取抗原，分别通过MHC-Ⅰ类和Ⅱ类途径激活CD8+、CD4+T细胞，从而共同分泌细胞因子或直接杀伤肿瘤细胞产生抗肿瘤免疫反应。鉴于白血病患者的DC数量减少和功能缺陷，近年应用体外扩增来增加数量，并且使用各种形式的肿瘤抗原在研究过程中来修饰DC，使其致敏后再回输体内，以期增强特异性的抗肿瘤免疫应答。
目前体外扩增DC主要来源于:骨髓CD34+干细胞、外周血单个核细胞、脐带血CD34+干细胞。适当的细胞因子配伍和不同的应用顺序对DC的诱导培养影响很大。常用的细胞因子为rhGM-CSF+rhIL-4+TNF-α，rhGM-CSF可以调控CD34+细胞向粒系分化并产生CFU-DC，是维持DC分化发育的最基本的细胞因子；rhIL-4可以抑制DC向巨噬细胞分化，并维持其处于未成熟阶段，从而使其具有较强的负载和递呈抗原的潜能。TNF-α是促进DC成熟的重要细胞因子，此外SCF、Flt3、IL-3等均有助于提高DC的产量［6～8］。
本研究在体外应用rhGM-CSF+rhIL-4+TNF-α诱导培养外周血来源的DC前体细胞定向分化为DC，使其扩增，经倒置显微镜观察及流式细胞仪鉴定，获得了经典DC形态并高表达共刺激分子，也为下一步抗原负载DC，增加T细胞的杀伤活性提供可靠的细胞来源。证实rhGM-CSF+rhIL-4+TNF-α的组合是有效的。
体外诱导培养DC可避免DC成熟障碍，而各种抗原负载方案均有利于DC对白血病抗原的摄取、加工，并可以MHC分子抗原肽的形式递呈给CD4+Th细胞和CD8+的CTL，从而打破免疫耐受，启动特异性白血病的免疫应答。体外负载肿瘤抗原的方式主要包括以下几种：（1）肿瘤细胞与DC融合；(2)肿瘤细胞裂解物负载DC；（3）凋亡肿瘤细胞负载DC；（4）肿瘤细胞基因转到DC；（5）肿瘤细胞来源的RNA致敏DC；（6）肿瘤特异性多肽致敏DC。
我们的研究即采用肿瘤细胞裂解物负载DC的方法，这种方法主要通过反复冻融法和超声破碎肿瘤，离心过滤获取肿瘤细胞的裂解上清液，加入DC的培养液中联合培养。该方法更符合生理过程;可递呈已知的和未知的肿瘤相关抗原，增加了触发特异性T细胞的靶点，并避免递呈单个或几个抗原而可能导致的免疫逃逸。DC对冻融抗原的内吞摄取能力很强，负载效率在90%以上远远高于肿瘤细胞与DC融合，但冻融抗原负载诱导抗原特异性CTL的效应却不及融合方法。Lee等〖9〗对2例AML外周血干细胞移植后复发病例研究中，白血病细胞冻融产物负载自体外周血单核细胞来源DC，用5～12×106细胞数的DC疫苗间隔2～3周共4次进行人体皮下注射，未发现明显的副作用。提取病人CD3+T细胞与负载抗原的DC进行混合淋巴细胞反应(MLR)，与注射前比较，注射后诱导更强的MLR反应，最终病人虽然没有获得血液学上的改善，认为与输注剂量偏小有关。
本实验通过反复冻融法制备K562细胞裂解物，台盼兰染色观察细胞裂解率达99%以上。负载正常人外周血来源的DC后与自体T细胞共培养，最后与K562细胞按5∶1、10∶1、25∶1的效靶比共同培养，用LDH法检测T细胞对K562细胞的杀伤率。并用流式细胞仪检测负载抗原的DC与未负载DC的黏附分子及共刺激分子的表达率。结果表明负载抗原的DC组对K562细胞的杀伤率明显高于单纯IL-2培养的T细胞，及未负载抗原的DC组，说明经反复冻融负载可溶性蛋白抗原诱导的CTL活性强于不加可溶性抗原组。DC摄取更多的可溶性抗原能产生更为有效的递呈作用，然后将肿瘤抗原加工成抗原肽，由MHC-Ⅰ类分子递呈给CD8+细胞毒性T细胞，再由CTL特异性杀伤带有肿瘤抗原的K562细胞；也可能通过MHC-Ⅱ类分子递呈给CD4+辅助性T细胞，产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子辅助杀伤肿瘤细胞。
我们的实验研究通过测定DC细胞培养上清液中IL-12ｐ70的含量，比较各组DC成熟程度及免疫递呈和激活淋巴细胞作用。白细胞介素12(IL-12)是由ｐ35(35 kD)和ｐ40(40 kD)两个亚单位组成有生物活性的异二聚体ｐ70(70 kD)，能促进T细胞和NK细胞的增殖、增强细胞毒活性、促进产生IFN-γ，是诱导TH1应答最重要的细胞因子，在机体抗感染、抗肿瘤中具有重要作用〖10〗。许多抗原递呈细胞可以产生，但DC是最主要的。我们的结果可以看出负载抗原后与未负载DC，及单纯T细胞组相比，IL-12的分泌明显增加，进一步证实较负载抗原后的DC更加成熟，能促进TH0向TH1分化，从而产生TH1应答和CTL应答。因为DC必须发育到一定阶段才能产生IL-12，尽管未成熟DC也能产生IL-12，但相对成熟DC却明显减少。同时在DC的发育和成熟过程中，IL-12的分泌对DC功能的发挥也起着至关重要的作用。Curti等的研究也证实在AML-DC诱导培养后，imAML-DC分泌的IL-12明显少于mAML-DC，同时发现来源于CD14+的AML-DC较CD14的AML-DC分泌IL-12多，进一步说明肿瘤的微环境对DC分泌IL-12也有密切影响〖11〗。4 小结
用GM-CSF、IL-4及TNF-α等细胞因子在体外联合诱导培养健康人外周血单核细胞可以得到成熟的DC，且经K562细胞裂解液脉冲致敏可以进一步促进DC的成熟。
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作者单位：100730 北京，首都医科大学附属北京同仁医院血液科