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【摘要】 目的 了解长春地区HCV基因分型情况，为HCV感染者的诊断和治疗提供重要的科学依据。方法 荧光定量RT-PCR检测97例抗-HCV阳性血清标本，并对89例HCV-RNA阳性的血清标本应用基因芯片法进行HCV基因分型。结果 89例阳性标本中HCV1b型49例，HCV2a型37例，HCV1b/2a混合型3例。结论 长春地区HCV基因型主要为1b型，2a型次之，同时存在HCV1b/2a混合型。
【关键词】 丙型肝炎病毒；荧光定量RT-PCR；基因分型
Genotyping of hepatitis C virus in Changchun
MA Yin-fu，YANG Guang-min，WANG Chang-jia，et al.Central Laboratory，People’s Hospital of Jilin Province，Changchun 130021，China
［Abstract］ Objective To investigate the distribution of hepatitis C virus （HCV） genotypes in Changchun and to provide information for the diagnosis and treatment of HCV.Methods Eighty-nine samples HCV-RNA positive from 97 samples anti-HCV positive sera by fluorescence quantitative RT-PCR were further genotyped by gene chip.Results Forty-nine sera was type 1b，37 sera was type 2a and 3 sera was 1b/2a mixed-type among 89 samples with HCV-RNA positive.Conclusion HCVlb is the most dominant genotype，HCV2a is the second and HCV1b/2a mixed-type also exists in Changchun.
［Key words］ hepatitis C virus;fluorescence quantitative RT-PCR;genotype
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起输血后非甲非乙型肝炎的主要病原分子。HCV是小的有包膜的单股正链RNA病毒，属黄病毒科丙型肝炎病毒属，颗粒大致呈球形，直径约50nm，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有突起，长约9400个核苷酸。人感染丙肝病毒后比感染乙肝病毒更容易转化成慢性肝炎，并可能发展成肝硬化和肝癌。HCV基因型不仅影响着丙肝的临床发展过程，而且与抗病毒治疗和肝细胞癌的发生密切相关。因此，如何尽早、及时和准确地检测出HCV基因型显得非常重要。目前已报道HCV的主要基因型多达11个，基因亚型超过70种［1］。为了解长春地区HCV基因型分布状况，对本地区97例抗-HCV阳性血清标本进行了HCV基因型分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料 试验组为吉林省人民医院院门诊及住院患者97例抗-HCV阳性血清标本，其中男63例，女34例，有输血史61例，年龄6～76岁。阴性对照组为10例健康体检者血清标本。
1.2 试剂 丙型肝炎病毒（HCV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒：购于中山大学达安基因股份有限公司。丙型肝炎病毒基因分型检测芯片试剂盒：由中科院上海微系统与信息技术研究所研制，宁波瑞芯生物科技有限公司生产。自备试剂：氯仿、异丙醇、75%乙醇。
1.3 仪器 美国PE-7300荧光定量PCR，美国HBPX222U型扩增仪，fresco型低温离心机，BENQ 5000S扫描仪等。
1.4 方法
1.4.1 HCV-RNA定量检测 按照丙型肝炎病毒（HCV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒使用说明书进行操作，（1）RNA提取；（2）逆转录；（3）PCR扩增及荧光检测；（4）结果分析。抽取HCV-RNA含量≥1.0×103拷贝/ml的阳性标本进行基因分型检测。
1.4.2 HCV基因分型检测 按照丙型肝炎病毒基因分型检测芯片说明书进行操作：（1）RNA提取与逆转录；（2）PCR扩增；（3）扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；（4）芯片杂交与显色。
2 结果
2.1 HCV-RNA定量检测结果 97例抗-HCV阳性标本中HCV-RNA含量≥1.0×103拷贝/ml的标本为89例，HCV-RNA含量＜103拷贝/ml有8例，具体检测结果如表1。表1 HCV-RNA含量检测结果
2.2 HCV基因分型检测结果 对89例HCV-RNA含量≥1.0×103拷贝/ml的标本和10例健康体检者进行基因分型检测。PCR扩增产物电泳阴性对照和阳性标本在芯片上进行杂交、显色，检测结果见图1：a为阴性，b为HCV1b型，c为HCV 2a型，d为HCV 1b/2a混合型。 荧光定量PCR检测HCV-RNA阳性的89例标本其不同基因分型具体检测结果见表2。表2 HCV基因分型结果
3 讨论
HCV基因型别的分布与地域有很大关系。现知欧美国家多数HCV1a型感染，而亚洲国家以1b型为主，2a型次之；3a型在泰国、新加坡较多；中东、南非和香港地区常见的基因亚型分别为4a、5a和6a；中国地区丙肝基因型以HCV1b型为主，其次为2a型，另有少量的2b型存在［2～4］。本文检测89例HCV-RNA阳性标本结果显示HCV1b型49例占55.0%，2a型37例占41.6%，1b /2a混合型3例占3.4%。说明长春地区以1b型为主，2a型次之。
本文基因芯片法定性检测HCV-RNA与荧光定量PCR检测HCV-RNA阳性符合率为100%。10例健康对照者血清基因芯片检测结果均为阴性，阴性符合率为100%。说明基因芯片法定性检测HCV-RNA结果可靠。应用基因芯片法进行基因分型不仅具有准确性好、灵敏度高、特异性强的特点，而且简便、快速，不需荧光标记和专用的荧光扫描仪。根据文献报道［5］，HCV-RNA定量检测的阳性率比抗-HCV的阳性率高。本文结果显示：97例抗-HCV阳性标本中，HCV-RNA含量＜103拷贝/ml有8例。推测其原因为患者经过一段时期的抗病毒治疗，病毒复制减弱或停止，血中HCV- RNA病毒含量极低。
HCV是一种全球性传染的、给人类健康带来极大威胁的病原体，是引起人类慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一［6］。国内外研究表明，HCV不同的基因型对肝脏损伤的程度不同，1b型对肝脏的损伤要比其他型严重得多［7］。HCV对干扰素的应答率也不同，Kandi等［8］报道HCV1b型感染多为慢性活动性肝炎，2a型比1b型对干扰素敏感。综上所述，HCV基因型与肝病严重程度有着密切关系，并且对抗病毒治疗产生很大影响。因此，HCV基因分型检测可为HCV感染者的诊断和治疗提供重要的科学依据。
【参考文献】
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6 庄辉.重视丙型肝炎的研究.中华肝脏病杂志，2004，12（2）:65.
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8 Kandi K，Kako M，Okamoto H.HCV genotypes in chronic hepatitis C and response to interferon.Lancet，1992，339:1543.
（编辑：宋 青）
作者单位：130021 吉林长春，吉林省人民医院中心实验室