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【摘要】 实体瘤内存在低氧代谢区，故可利用趋低氧的厌氧菌作为肿瘤基因治疗的载体。厌氧菌作为基因治疗的载体，具有肿瘤靶向性强、安全性高等特点，是一种新型的基因治疗载体。当厌氧菌携带具有治疗作用的目的基因时，可有效的抑制实体瘤细胞的生长。现综述双歧杆菌、乳酸杆菌和梭状芽孢等厌氧菌作为肿瘤基因治疗载体的研究进展。
【关键词】 厌氧菌 肿瘤 基因治疗
Research on anaerobes as vector in gene therapy of solid tumors
ZANG Jie,KONG Qing-li.Capital Medical University,Beijing 100069,China
［Abstract］ Solid tumors often contain hypoxia regions around the areas of necrosis.Some anaerobic and facultative bacteria have been used experimentally as anticancer agents because of their specific targeting to the hypoxia regions of solid tumors after systemic administration.Studies have shown that anaerobic bacteria is a high selective and safe tumor targeting delivery vector especially when administered with different therapeutic genes.Anti-tumor gene therapy mediated by anaerobic bacteria such as Bifidobacterium,Lactobacillus and Clostridium,has been proved to be a potential efficient clinical method in the future.
［Key words］ anaerobic bacteria；solid tumor；gene therapy
随着分子生物学的发展和基因工程技术的完善，基因治疗开创了疾病治疗的新途径，已经逐渐成为医学领域的一个研究热点。以往使用的病毒和非病毒基因转移载体存在着靶向性、安全性、可行性等方面的问题，从而限制了基因治疗的发展［1］。厌氧菌因其趋低氧的特性而决定其必然对体内低氧区存在较好的靶向性，部分致病力弱或非致病菌株的发掘给安全性提供了保证，其作为基因转移载体的出现突破了基因治疗现存的难题，提供了新的发展空间。目前厌氧菌作为基因转移载体的研究主要集中于肿瘤的治疗、基因疫苗的制备、基因缺陷疾病的治疗等方面，在动物模型的实验研究中，转移载体均发挥了很好的作用，取得了较为满意的治疗效果，部分成果已初步应用于临床，发展前景确实非常乐观。现就几种常见厌氧菌在基因治疗中靶向性、安全性及联合治疗等方面的进展做一综述。
1 厌氧菌作为基因治疗载体的条件
1.1 基因治疗的现状和存在的主要问题 基因治疗是指将具有治疗作用的基因通过适当的载体导入人体细胞，使其在细胞内表达出具有治疗作用的基因产物，从而改善疾病的症状或达到对疾病的治疗［2］。
基因治疗的应用面比较广泛，是当前肿瘤治疗领域的一个热点。但目前基因治疗肿瘤面临着许多问题：基因转移载体的选择和构建；治疗基因的选择和转化；如何提高载体表达效率和载体对特定组织的靶向性等问题［3］。其中转移载体的靶向性是基因治疗中最亟待解决的焦点问题。
现在常用的基因转移载体系统主要包括病毒载体系统和非病毒载体系统［4,5］。病毒载体系统包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等［2］。非病毒载体系统主要包括裸DNA、RNA-DNA嵌合体、脂质体及多肽等［4］。上述载体系统在肿瘤基因治疗中的靶向性不够理想，在到达肿瘤区域的过程中面临着生理、生化和免疫上的许多限制：（1）病毒和非病毒载体较难通过血管壁和组织间质；（2）肿瘤组织血管增生、血流紊乱导致载体不能全部进入病灶；（3）肿瘤组织的血管因通透性和渗透压较高排斥已进入的载体；（4）宿主免疫系统可通过免疫监视和免疫防御功能破坏载体［6］；（5）病毒载体会刺激机体产生一定的免疫反应，从而诱发体内正常组织细胞转化，有致癌、致毒的风险［2］；（6）非病毒载体的基因导入率和表达效率低，在体内易被降解［4］。总之，目前所用的病毒和非病毒载体系统存在靶向性不强、基因表达效率不高及安全隐患等问题，制约了基因治疗的应用。因此寻找更为理想的基因载体就成为基因治疗发展趋势。
1.2 肿瘤内部存在低氧代谢区的机制 肿瘤的生长依靠新生血管提供营养和氧气。肿瘤细胞聚集形成之后是无血管生长期，此时肿瘤细胞通过弥散作用获取营养和氧，并运出代谢产物。此时期肿瘤体积不超过2 mm3，细胞数约几百万个，且瘤细胞的增殖速度并不是很快。由于肿瘤细胞可无限快速增殖分裂，当其体积逐渐超过一定限度（1～2 mm3）后，就不能单纯依靠弥散获取足够的营养和氧分而使部分肿瘤细胞处于乏氧状态［9］。此时若无新生毛细血管长入，肿瘤组织将保持在休眠状态或发生退化。在一般情况下，乏氧会导致血管内皮生长因子（VEGF）产生并诱导新生血管迅速生长，新生血管长入后，肿瘤的血供由弥散变为灌注，细胞呈指数增长，瘤体体积迅速增大。但肿瘤组织中的新生血管在结构和功能上不同于正常组织中的血管，会导致血流在时间和空间上的分布异常，造成肿瘤细胞生长迅速而营养、氧气供应相对不足，使部分肿瘤细胞坏死，在实体瘤内部形成一定的低血流量低氧区域，此即肿瘤内的相对乏氧区和坏死区［7］。现已证实，在许多人和啮齿类动物的肿瘤，尤其是实体瘤内都存在低氧区域。Vaupel采用氧电极测定法对癌症患者进行研究，发现正常组织细胞的氧分压为24～66 mm Hg，而实体瘤组织内的氧分压约为10～30 mm Hg，有些部位的氧分压甚至低于2.5 mm Hg［8］。毛细血管150～200 mm以外的肿瘤区域，氧分压几乎为零。实体瘤内部的相对乏氧状态一直被认为是肿瘤治疗抵抗的原因之一。低氧区的肿瘤细胞对放疗、化疗常常不敏感，并与肿瘤细胞的恶变、侵袭和转移能力相关［9～11］。
1.3 厌氧菌作为基因治疗转移载体的优势 由于肿瘤组织内部的特殊的病理生理特点和厌氧菌本身的生物学特性，决定了厌氧菌作为肿瘤基因治疗的载体具有多种优势：（1）厌氧菌对肿瘤组织具有较好的靶向性：肿瘤细胞生长旺盛而血供相对不足，造成了实体瘤内部微环境相对缺氧，为厌氧菌提供了适宜的生存场所。厌氧菌经静脉注射后能选择性地富集于乏氧的肿瘤组织内，并可在肿瘤组织内生长，而正常组织中定植的厌氧菌数量极少且基本上不能生长。（2）厌氧菌在瘤内较难被免疫系统识别清除:肿瘤内血管生长的异常和肿瘤组织间隙的高压环境阻止了免疫成分（白细胞、抗体、补体等）随血流进入肿瘤组织，使肿瘤组织成为厌氧菌免疫逃避的场所，从而提高了厌氧菌在肿瘤组织内的有效浓度［12］；（3）厌氧菌在瘤内具备繁殖条件和能力：由于肿瘤组织代谢旺盛，可以产生大量的中间产物以供分布其中的厌氧菌利用，因此在相同时间内，肿瘤内厌氧菌的聚集和增殖程度远高于其他的正常组织［13］；（4）一些厌氧菌本身就具有溶瘤作用：早在1947年，Parker等就首次报道了厌氧菌具有溶瘤作用，将溶组织梭状芽孢杆菌的孢子进行瘤体内直接注射，小鼠转移性肉瘤消退［14］。1967年，Carey等将丙酮丁酸梭状芽孢杆菌的孢子以1010经尾静脉推注给癌症患者，再次观察到了瘤体内大量细菌定植及溶瘤效应的发生［15］。早期研究证实了部分厌氧菌确实有溶瘤作用。厌氧菌的溶瘤机制，可能是厌氧菌能产生过氧化氢和激肽酶而具有溶瘤作用；（5）厌氧菌可以经基因工程转入多种治疗基因并具备较好地表达外源基因的能力；（6）厌氧菌相对安全：一些厌氧菌本身就是机体的生理益生菌，可对机体产生有益的保护作用，而一些致病菌也可通过基因敲除或改造使其毒副作用减弱甚至消失。相对于病毒等载体而言，厌氧菌的安全性较高；（7）易于从外部控制：经基因工程改造的厌氧菌对多种抗生素敏感，即使进入体内引发了不良的机体反应，也可通过使用抗生素较好的得到控制。；（8）作为基因转移载体，厌氧菌的细胞组织转移范围比病毒载体更为广泛。
1.4 理想厌氧菌应具备的特点 （1）对宿主无毒性；（2）具有较高的靶向性，仅在肿瘤组织中增殖而在正常组织中不能生长；（3）在瘤体内有良好的增殖分裂能力；（4）具有高效表达转入菌体内的外源基因的能力；（5）能通过生长中争夺营养，局部产生细胞毒性或表达治疗基因而引起肿瘤消退；（6）有运动能力，可分布于整个肿瘤组织；（7）本身即具有溶瘤效应；（8）无免疫原性，不引起机体免疫应答；（9）对抗生素敏感，可控制其生长，治疗后易于从宿主体内彻底清除。
2 常用厌氧菌基因转移载体的研究现状
长期以来，研究工作一直致力于从各种厌氧菌中筛选出接近上述特点的厌氧菌属,并对其基因治疗的效果进行实验评价。目前主要研究的厌氧菌属有双歧杆菌属、沙门菌属、梭状芽孢杆菌属和乳酸菌属。
2.1 双歧杆菌属 双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类与人体健康关系密切的生理益生菌，属G+厌氧菌，在不同条件下可呈现不同形态。双歧杆菌通常寄居在人体和其他哺乳动物的肠道内，是正常菌群的一员，本菌无芽孢、无荚膜、无鞭毛、无运动性，不产生内毒素和外毒素，对人无致病性，进入人体后不产生任何不良反应，其使用的安全性已得到普遍认可。经药敏实验测定，双歧杆菌对红霉素、氯霉素、克林霉素、头孢类、大环内酯类等抗生素表现为敏感［16］。双歧杆菌不仅对机体无毒无害，还发挥着多种重要的生理作用：（1）在机体内作为生物屏障，可以阻挡致病性细菌的繁殖和入侵，抑制腐败菌的生长，调整人体肠道内正常菌群的微生态平衡；（2）可以合成维生素等机体生长所必需的营养物质；（3）可以增强宿主全身的免疫功能，提高巨噬细胞、NK细胞和B淋巴细胞的功能活性，发挥抗肿瘤、抗感染的功效；（4）双歧杆菌在控制内毒素血症、降低血胆固醇、延缓衰老等方面也有明显的作用［17～20］。
与其他厌氧菌相比，双歧杆菌抗原性相对较弱而安全性较高，非常适宜作为基因治疗的载体，具有良好的应用前景和广阔的发展空间。目前可用于基因治疗的载体主要有长双歧杆菌（B.longum）、短双歧杆菌（B.shortum）、婴儿双歧杆菌（B.infantis）、青春双歧杆菌（B.adolescentis）和两歧双歧杆菌（B.bifidum）五种［21］。
Yazawa等将长双歧杆菌活菌105-A株和108-A株分别经鼠尾静脉注入Lewis肺癌小鼠体内，每只鼠细菌总量为5～6×106个活菌，在168 h后处死小鼠，并取心、肝、脾、肺、肾和整块肿瘤组织，匀浆后做厌氧培养，3天后在肿瘤组织培养皿中见到400个双歧杆菌菌落生长，瘤组织中细菌数为6×104/g，而正常组织中则没有发现双歧杆菌。此后，又以同样的菌量将长双歧杆菌108-A株静脉注射给荷瘤小鼠（B16-F10黑色素瘤），96 h后仅在瘤组织中检测到长双歧杆菌，且在整个实验过程中未见小鼠出现由细菌进入体内所导致的任何不良反应。此后，Yazawa又将经基因工程改造的长双歧杆菌105-A株细菌总量为2×108经静脉注射给荷瘤小鼠。168 h后，同样发现长双歧杆菌能够靶向性定植于瘤体中没，而正常组织中未见。上述实验证明长双歧杆菌确实能够选择性在肿瘤组织内定植和生长而不累及正常组织，具有较好的靶向性［22,23］。
对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因系统的研究现已比较成熟。CD酶可将无毒性的原药5-氟胞嘧啶代谢成细胞毒性产物5-氟尿嘧啶，从而在肿瘤局部专性杀死癌细胞。易成等用婴儿双歧杆菌作为治疗基因的转运载体，构建了含自杀基因CD的原核表达载体，用电击法对其进行转染，并对体内和体外的抑瘤效果分别进行了测定。将重组的婴儿双歧杆菌与CD酶底物5-FC在厌氧条件下温育后，收集上清液加入到B16-F10黑色素瘤细胞上观察其细胞杀伤效果。同时建立黑色素细胞瘤B16-F10小鼠模型，经尾静脉注入含CD基因的重组婴儿双歧杆菌之后腹腔注射5-FC。结果表明，体外实验中，实验组B16-F10肿瘤细胞发生显著的形态学改变，细胞生长受到很大程度的抑制，对照组肿瘤细胞未见改变；在小鼠动物模型实验中，重组婴儿双歧杆菌靶向定植于瘤组织局部，实验组肿瘤体积明显小于对照组，显示其细胞生长受到了明显抑制。该实验表明婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC自杀基因疗法在体外和体内都具有良好的抑制肿瘤生长的效果［24,25］。
在上述CD基因疗法的基础上，安丽娜等又进一步研究了尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因（UPRT）对CD/5-FC自杀基因系统抗瘤作用的增强效应。构建了pGEX-UPRT表达质粒转化婴儿双歧杆菌，筛选阳性菌株进行了体外的细胞毒性实验。将重组的婴儿双歧杆菌按上述相同方法温育后收集上清液加入B16-F10黑色素瘤细胞中。结果显示，含UPRT基因的实验组与仅含CD基因的对照组细胞均出现形态和内部结构的损伤性改变和死亡，但CD+UPRT组瘤细胞的存活率明显低于对照组，证明了UPRT能有效增强肿瘤细胞对5-FU的敏感性，与CD基因协同可产生更为强大的杀伤效应［26］。
对于上述自杀基因疗法，Fujimori等曾对此种双歧杆菌载体的安全性进行了测定。使用几内亚猪对携带有CD基因重组质粒的长双歧杆菌对实验动物可能产生的过敏性及免疫反应进行了实验。经ASA反应和PCA反应检测，未发现经转染的双歧杆菌对几内亚猪产生任何过敏症状，同时也没有检测到该双歧杆菌在猪体内诱导出的特异性抗体［27］。证实了长双歧杆菌作为基因治疗载体对哺乳动物确实是安全的。
除CD基因外，还有一些抑癌基因被相继发现并被研究证实具有较好的应用前景。如PTEN基因，其表达产物具有多种生物学功能，可抑制细胞内信号传导通路，诱导细胞周期停滞，增加p53抗癌蛋白的稳定性，抑制细胞迁移和实体瘤内微血管的形成。侯鑫等成功合成了长双歧杆菌质粒pMB1及HU启动子序列，并插入PTEN基因构建了重组质粒pMB-HU-PTEN，电击转化长双歧杆菌。将重组的菌悬液尾静脉推注给荷瘤小鼠，与对照组不含PTEN基因的长双歧杆菌相比，其肿瘤重量明显减轻而抑瘤率高约39%，证实了PTEN基因显著的肿瘤抑制效应［28］。
内皮素（Endostatin）为另一个重要的具有抑瘤效应的基因，其具有明显的抗肿瘤血管形成的作用。徐根兴等将内皮素基因分别转化青春双歧杆菌和长双歧杆菌，经尾静脉推注和口服途径给予实体瘤小鼠，发现双歧杆菌高靶向性定植于瘤组织中，且强烈抑制肿瘤血管生长，延长了带瘤小鼠的存活时间。在长双歧杆菌的实验中，加入微量硒元素还可以上调免疫细胞如NK、T细胞的活性并增加细胞因子IL-2、TNFα的表达，具有很好的抑瘤作用［29］。
双歧杆菌用于基因治疗与其他治疗方法相比，具有靶向性好、安全性高、效果显著等优势，是一种理想的基因治疗载体，但作为载体，其目前最大的问题是双歧杆菌的质粒相对较少，且提取困难，其24个分型中仅有5型中发现有质粒存在，在发现的质粒中，大小都在8 kb以上，也不适合于作载体的构建［30,31］，成为其应用于基因治疗的瓶颈。目前的研究和实验中虽然成功地构建了许多穿梭表达载体如pMB、pGEX、pBV200、pBLES100等，已经能够表达特定的产物且发挥了特定基因的疗效，但是其存在的稳定性和表达产物的高效性还有待进一步提高和完善。因此，分离出更多的双歧杆菌质粒，构建高效的表达载体对双歧杆菌的研究和应用具有重要意义，这个问题的解决也将会为双歧杆菌的基因治疗带来更理想的发展前景。
2.2 沙门菌属 沙门菌属（Salmonella）是一种G-兼性厌氧菌，在有氧和乏氧的环境中均可存活，属于胞内寄生菌。伤寒沙门菌（S.typhimuriun）属于沙门菌中的D群，不形成芽孢，无荚膜，呈短杆状，有鞭毛，能运动，不产生外毒素，其菌壁成分LPS为其内毒素，是伤寒的致病菌。
Pawelek等将野生型鼠伤寒沙门菌14028WT（4×106菌量）腹腔注射至荷瘤小鼠体内，2天后发现每克瘤体组织内含有（6.5～6.8）×109的野生型鼠沙门菌，此菌在肿瘤组织和正常组织中的分布比例为270∶1，说明沙门菌具有对肿瘤的靶向性，但由于细菌毒力的作用，小鼠最终很快死亡［32,33］。Pawelek等因此又构建了敲除msbB、purl、xyl,带有EGTAγ的减毒株VNP2009，使细菌毒力和侵袭力显著降低；并且发现msbB缺陷的菌株对多种抗生素都敏感，因而可避免细菌在体内大量繁殖却难以控制而可能导致的菌血症和脓毒血症，提高了沙门菌基因治疗的安全性。静脉给予荷瘤鼠减毒株沙门菌后，发现该菌可在肿瘤细胞外成分中富集，肿瘤组织中和正常组织中菌量之比为300∶1～1000∶1［34］。在此之后，为直接观察细菌在肿瘤组织中的定植情况，Zhao等用绿色荧光蛋白（GFP）基因标记伤寒沙门菌A1，用红色荧光蛋白基因标记PC-3前列腺癌细胞，从静脉给予荷瘤鼠（PC-3-RPF前列腺癌皮下移植瘤），分别在注入菌液的2、4、6、8、10、15天取肝和脾，不做任何处理，直接在荧光显微镜下观察荧光强度随时间的变化。到15天时，肾、肝、脾、肺中已无标记细菌［35］。以上研究充分证明鼠伤寒沙门菌减毒株比野生株对肿瘤具有更高的靶向性，是基因治疗比较理想的转移载体。但实验同时还表明，沙门菌减毒株VNP2009虽然可以比较安全地应用且具有较高的允许剂量，但是单独运用没有明显的抗肿瘤效果［36］。
沙门菌是较早深入研究的细菌之一，关于沙门菌的基因治疗涉及的范围也相应比较广泛。在肿瘤治疗方面，减毒沙门菌介导的各种治疗基因均在实验中发挥了很好的效果。King、Jazowiecka等分别将表达CD基因的不同株鼠伤寒沙门菌减毒株通过静脉注入荷瘤小鼠体内，将5-氟胞嘧啶（5-FC）于腹腔内用药。结果显示，CD基因表达在肿瘤和正常组织内比值为1000∶1，正常组织内未发现5-FU，而且抑瘤率明显高于单用5-FC的对照组，实验组小鼠生存时间也显著延长［37，38］。Nemunaitis等在临床上也曾应用CD基因疗法治疗恶性肿瘤病人，发现组织内有载体沙门菌定植的病人其肿瘤确实得到了一定程度的控制且没有明显的不良反应产生［39］。Lee等将带有thrombospondin-1（TSP-1）基因的伤寒沙门菌作为转移载体用于试验治疗同种B16-F10小鼠模型的原发黑色素瘤和肺部转移瘤。该细菌均选择性富集于肿瘤组织，同时TSP-1基因在肿瘤组织的表达量是肝、肾组织的1800倍。表达的基因产物显著地抑制了瘤体生长，降低了瘤组织中的微血管密度，提高了小鼠存活率［40］。他们又将携带内皮素基因的减毒沙门菌腹腔注射黑色素瘤和膀胱癌小鼠，肿瘤生长的抑制率达40%～70%，显著延长了小鼠生存时间，在降低了血管内皮生长因子（VEGF）在瘤组织内表达量的同时，增加了CD8+T细胞的浸润。由于细胞因子的产生在机体的免疫机制中发挥着非常重要的作用，因此提高一些细胞因子的表达量对疾病的控制具有很好的效果［41］。在利用沙门菌作为载体传递表达细胞因子方面，QiH等将带有IL-12质粒的沙门菌SL3261作为口服基因转移载体，可以使带瘤小鼠血清中IFN-γ和IL-12水平显著升高，其存活时间与对照组相比也有较大提高［42］。Urashima等发现口服表达CD40配体的减毒沙门菌ST40L不仅可以上调Fas、B7-1、B7-2等分子的表达，还能加强机体产生IFN-γ和TNF-α等保护性免疫应答，能有效抑制B细胞淋巴瘤在小鼠体内的生长［43］。除以上两方面外，何平等将携带有pCMVβ的减毒沙门菌SL207作为DNA疫苗的载体，通过口服途径免疫小鼠，发现该菌能有效地将质粒DNA传递给抗原呈递细胞并进行表达，诱导出以细胞免疫为主的免疫应答［44］。Huggins等以带有IL-2的沙门菌作为载体，以系统性红斑狼疮（SLE）小鼠模型为对象，发现IL-2的基因治疗可以恢复缺陷T细胞的正常增殖，抑制自身抗体的产生，从而对自身免疫疾病具有一定的治疗作用［45］。还有研究通过将血小板因子4及烷基转移酶基因导入沙门菌，分别用于治疗大剂量的辐射损伤和降低一些烷基化合物对机体的毒害作用，均获得了较为理想的结果［46,47］。
虽然减毒沙门菌目前在基因治疗中的应用比较广泛，并且在动物实验中取得了较为满意的结果，但其在临床应用中仍存在一定的安全隐患。如：（1）肿瘤基因治疗的途径是以全身给药最为可行，沙门菌本身为致病菌，可能在血中大量繁殖引发菌血症；（2）G-细菌的菌壁成分LPS可导致内毒素血症的发生，还可以引起机体TNF-α大量释放；（3）沙门菌属于兼性厌氧菌，其靶向定植于乏氧组织的特异性还有待于进一步提高。虽然减毒处理在一定程度上可以降低其毒副作用，但安全隐患终究存在，作为要应用于临床的基因治疗转移载体，只有很好地解决了安全性问题，才能充分发挥其治疗多种疾病的作用。
2.3 梭状芽孢杆菌属 梭状芽孢杆菌属，简称梭菌属（Clostridium）,为一大类厌氧或微需氧的G+粗大杆菌，菌体中央或次极端有耐热的圆形或椭圆形芽孢，使菌体膨胀呈梭状。其中某些菌种可以产生毒性很强的外毒素和侵袭性酶类，对人或动物致病。目前用于基因转移载体的主要是诺氏梭菌（C.novyi）、产芽孢梭菌（C.sporogenes）、拜氏梭菌（C.beijerinckii）、溶组织梭菌（C.histolyticum）和丙酮丁酸梭菌（C.acetobutylicum）。
梭状芽孢杆菌是现在常用的载体菌中唯一可以产生芽孢的菌种，所以在作为载体时与其他载体菌也略有不同。它不仅能以活菌的形式注入宿主体内后因趋低氧代谢而靶向定植，还可以芽孢的形式注入宿主体内，并由其生理特性所决定高选择性地在体内肿瘤的低氧坏死区域萌发后定居增殖。以梭状芽孢杆菌用于基因治疗目前的策略主要是使其携带如胞嘧啶脱氨酶（CD）、硝基还原酶（NTR）等毒性基因，转化产生毒性产物杀死瘤细胞；或是使其携带一些细胞因子的表达基因，如TNF、IL等，直接产生该细胞因子杀伤肿瘤细胞。
诺氏梭状芽孢杆菌：Dang等为了寻找一种理想的厌氧菌载体，在26株厌氧菌中筛选出一株能广泛分布于肿瘤乏氧区的野生菌—诺氏梭菌。动物实验中发现在初次使用诺氏梭菌孢子16～18 h后，所有实验动物均死亡［48］。Dang等认为，由于生长在肿瘤内的细菌产生并释放潜在致死性毒素是导致动物死亡的重要原因，因此他们通过热休克的方法去除其毒素基因，重新命名为减毒诺氏梭菌，并将其孢子经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内，通过苏木精-伊红染色显微镜观察证实减毒诺氏梭菌保留其野生型的特性，能靶向定植于肿瘤乏氧区，并导致坏死区扩大，同时发现在乏氧坏死区周围仍残存一圈肿瘤细胞，整个过程未见任何毒副反应［49］。
拜氏梭状芽孢杆菌:Fox等将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因（CD）克隆入拜氏梭状芽孢杆菌,在体外实验中前药物酶CD高水平表达并将前体药物5-氟胞嘧啶高效激活为毒性分子5-氟尿嘧啶,使瘤体缩小。该实验Fox等成功地利用前药物酶疗法,即以厌氧菌作为基因转移载体,将基因编码的前药物酶CD转运到肿瘤组织,增强化学药物的治疗效果。在随后的实验中,又将大肠杆菌硝基还原酶基因（NTR）克隆入拜氏梭状芽孢杆菌表达载体,并将其无活性孢子经尾脉推注给予EMT6荷瘤小鼠,5天后硝基还原酶基因仅在瘤组织中表达,而在正常组织中未见表达,从体内实验的角度证实了拜氏梭状芽孢杆菌作为肿瘤基因治疗转移载体的高度靶向性［50,51］。由于现有的梭状芽孢杆菌表达硝基还原酶的量及酶活性还很有限，其对肿瘤的杀伤作用还不够明显。Theys等在此基础上，对一系列硝基还原酶的活性进行了测定，选取了活性最高的一种酶通过接合法导入梭菌中，发现该重组菌可以高效率表达硝基还原酶，将无毒的前药CB1954转化为其毒性衍生物，其对肿瘤细胞的杀伤作用也因表达量的增加而大大提高，应用前景比较理想［52］。
丙酮丁酸梭菌：细胞因子用于肿瘤治疗是基因治疗的重要方面之一，Barbe等构建了表达细胞因子的重组菌，将IL-2的cDNA重组入丙酮丁酸梭菌DSM792内，并检测到重组的丙酮丁酸梭菌内含有0.8 mg/L具有生物活性的IL-2表达［53］。此外，Theys等将基因重组的丙酮丁酸梭菌于瘤内注入荷瘤鼠，5天后取肿瘤组织和正常组织观察，仅在肿瘤中可见细菌，而在肝和脾中则未见到，所带的目的基因也靶向性表达于肿瘤组织，同时该菌仅诱发宿主微弱的免疫反应，在任何阶段给予甲硝唑均可清除体内的细菌［54］。Pawelek将非致病性丙酮丁酸梭菌M55进行动物实验，结果表明梭状芽孢杆菌具有肿瘤靶向性，但其仅在乏氧及坏死明显的较大肿瘤内（2～4 g）增殖，在小的转移灶无确切靶向作用，病理显示肿瘤中央坏死，而周边仍有足以导致复发的肿瘤细胞存在［55］。Theys等还利用大肠埃希杆菌-丙酮丁酸梭菌穿梭质粒载体携带鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）基因,在体外实验中获得了高生物活性的TNF-α,说明丙酮丁酸梭菌可作为携带肿瘤治疗基因的载体。在随后的体内实验中,Theys等将携带CD基因的丙酮丁酸梭菌给予荷瘤小鼠后,厌氧菌在肿瘤组织内不断繁殖,小鼠横纹肌肉瘤大面积坏死［56］,说明丙酮丁酸梭菌作为肿瘤基因治疗载体具有很好的临床应用前景。
产芽孢梭状芽孢杆菌:对拜氏梭状芽孢杆菌和丙酮丁酸梭状芽孢杆菌的研究证实,梭状芽孢杆菌可选择性定植于肿瘤低氧坏死区域,但这两种梭状杆菌在肿瘤内的生长及所产生的抑瘤效应还不够理想。1982年Mose等分离出具有抑瘤效应的产芽孢梭状芽孢杆菌M55，Heppner等将其孢子以1010对癌症患者予以静脉注射,大部分患者瘤体缩小,而周围正常组织因无厌氧菌生长,未被损害,表明产芽孢梭状芽孢杆菌具有较强的肿瘤靶向性及抑瘤效应。Liu等以携带CD基因的产芽孢梭状芽孢杆菌静脉给予荷瘤小鼠,结果显示,无论是在肿瘤内的繁殖率还是在抑瘤效应上,产芽孢梭状芽孢杆菌均较拜氏梭状芽孢杆菌和丙酮丁酸梭状芽孢杆菌明显［57］。
2.4 乳酸菌属 乳酸菌是人体内寄生于人体肠道及其他器官内的非致病性G+厌氧菌，属于正常菌群，具有保护机体免受感染，提高免疫反应的重要作用，在食品行业及医学领域已得到广泛应用。由于其可以维持机体生态平衡，诱发黏膜免疫及无致病性的特点，作为某些免疫接种的疫苗载体也具有很大的优越性。应用于基因工程的前景十分广阔。乳酸菌主要包括23个属，其中与人类关系密切的有兼性厌氧球菌中的乳球菌属（Lactococcus）和无芽孢杆菌中的乳杆菌属（Lactobacillus）。
Kimura等给荷瘤小鼠静脉注射双叉乳酸杆菌,细菌量为5～6×106。48 h和96 h后,在瘤体内检测到大量繁殖增生的乳酸杆菌,而其他正常组织如肝、脾、肾、肺、血液、骨髓和肌肉等未见乳酸杆菌。此外,小鼠也未出现发热、菌血症及其他不良反应［58］。Kimura等的实验说明,乳酸杆菌是一种靶向性非常强的非致病性厌氧菌。
3 小结
厌氧菌作为肿瘤基因治疗的载体具有安全性好、靶向性高等优点。将厌氧菌改造为携带多种治疗基因的工程菌，使得厌氧菌治疗实体瘤的效果得到了很大程度的提高。由于治疗基因在体内的表达效率还不够理想，部分厌氧菌仍存在安全隐患，且治疗策略单一，从而限制了厌氧菌的应用。今后的研究应致力于改进基因工程技术，提高治疗基因的表达效率，筛选出靶向性更强的厌氧菌株并确保其应用的安全性，相信厌氧菌在实体瘤基因治疗方面必将发挥出更大的作用，拥有更为广阔的发展前景。
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（编辑：杨 熠）
作者单位：100069 北京，首都医科大学2004七年制临床2班（△基础医学院免疫学系）