点击显示 收起
【摘要】 目的 通过研究肝癌细胞的基因表达概况，筛选表达异常的抑制细胞凋亡相关基因，探索肝细胞癌发生的分子机制及病理指标。方法 通过基因芯片技术检测肝癌细胞系Bel-7402、Hep3B与胎儿肝细胞的全基因组序列，筛选表达差异的抑制细胞凋亡相关基因，利用RT-PCR、免疫组织化学对部分差异表达基因进行了验证。结果 在检测的54614个探针组中，与抑制细胞凋亡相关表达明显上调的基因有12个，选取其中2个基因SODD和survivin进行RT-PCR、免疫组化验证，结果与基因芯片结论基本一致。结论 肝细胞癌中的抑制细胞凋亡基因表达增高，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞产生和增殖。对这些基因的研究有助于阐明肝细胞癌发生分子机制及提供新的病理指标。
【关键词】 肝细胞癌 胞凋亡 SODD survivin
Comparative analysis on apoptosis inhibiting genes in hepatoma carcinoma cells
ZHANG Yong-chen，YE Wei，ZHAO Wei，et al.The Second Hospital Affiliated with Southeast University，Nanjing 210003，China
［Abstract］ Objective To explore the specific gene expression of hepatoma cell and identify the abnormal expression apoptosis inhibiting genes for exploring the molecular mechanism and pathobiology features of hepatocarcinom.Methods The profiles of gene expression of hepatoma cell lines Bel-7402、Hep3B and fetal liver cells were analyzed by gene chips.The abnormal expression apoptosis inhibiting genes were screened.The selected candidate genes were confirmed by RT-PCR in three kinds of cell lines and immunohistochemistry in 20 specimens of HCC and adjacent noncancerous tissues.Results Of the detected 54614 probe sets，compared with the fetal liver cells，1452 genes were up-regulated by more than 2 folds and 2054 genes were down-regulated by more than 2 folds in the hepatoma cell lines Bel-7402 and Hep3B，in which 12 abnormal expression apoptosis inhibiting genes were screened.The results of RT-PCR showed that the expressions of SODD and Survivin in hepatoma cell lines were higher than those in fetal liver cells （P<0.05）.The positive rates of SODD and Survivin were significantly higher in HCC than in adjacent noncancerous tissues.（63.6% vs 15%，72.7% vs 10%，P<0.05）.Conclusion Many cell apoptosis inhibiting genes are up-regulated in HCC which can inhibit cancer cell apoptosis and promote cancer cell proliferation.Analysis of these genes can provide important clues for disclosing the molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma pathogenesis and supply possible new pathobiology features.
［Key words］ hepatocellular carcinoma;cell apoptosis；SODD；survivin
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的肿瘤之一，死亡率很高。有资料表明，HCC其已经成为我国男性的第二大癌症死亡原因，女性的第三大癌症死亡原因［1］。肝癌的发生、发展是由数千个癌症相关基因异常表达引起，其中抑制细胞凋亡相关基因的异常表达起了重要的作用，对这些基因的研究多集中在某个或某几个基因的作用上，难以揭示其全貌。基因芯片技术是近年发展起来的一种新技术，能够同时研究同一标本或不同标本中成千上万个基因表达，是一种高通量、快速有效的基因表达分析方法［2］。本研究通过基因芯片技术分析肝癌细胞系Bel-7402、Hep3B基因表达概况，以胎儿肝细胞为正常对照，寻找差异表达基因，随后对表达异常的抑制细胞凋亡相关基因通过免疫组化进一步研究其在肝癌组织中的表达情况。旨在发现肝癌中异常表达的抑制细胞凋亡相关基因，有助于阐明肝癌的发病分子机制，同时可能为肝癌的诊断提供新的病理学指标。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集南京市第二医院2005～2007年手术切除的HCC组织22例、癌旁组织20例，所有标本经10％中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，病理诊断证实。22例肝癌患者中男17例，女5例，年龄30～65岁。其中病理分化程度：高分化3例，中分化17例，低分化2例。肝癌细胞系Bel-7402、Hep3B、胎儿肝脏细胞购自中国科学院上海细胞库。
1.2 主要试剂 RNeasy Mini试剂盒购于Qiagen公司，RT试剂及PCR试剂盒购自Tiangen公司。所需引物由南京金思特科技有限公司合成，兔抗人SODD、survivin多克隆抗体均购自美国Santa cruze 公司，工作浓度均为1∶100。免疫组化染色用的SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术公司。基因芯片采用Affymetrix公司提供的Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片，点样区内包含54614个探针组。
1.3 方法
1.3.1 Affymetrix基因芯片基础技术 Affymetrix基因芯片技术服务由上海晶泰生物技术公司提供。取对数生长期的Bel-7402、Hep3B与胎儿肝细胞用Trizol裂解并收集，干冰运送至上海晶泰生物技术公司进行以下操作：提取纯化总RNA，制备标记探针、芯片杂交、GeneArrayTM scanner 3000高分辨率扫描仪扫描芯片、GCOS软件进行数据分析。
1.3.2 筛选抗凋亡相关的差异表达基因 RT-PCR验证差异表达的基因，通过对基因芯片结果的分析筛选抗凋亡相关的差异表达基因。按QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit操作程序提取肝癌细胞系Bel-7402、Hep3B与胎儿肝细胞中的总RNA。用Tiangen公司的SUPER RNase H-Reverse Transcriptase合成第一链cDNA，方法如下：总RNA 2 μg，oligo（dT） 2 μl，dNTP（10uM）2 μl，加ddH2O至14 μl，70 ℃温育5 min，冰上2 min;加入5×First-Strand Buffer 4 μl，DTT 1 μl 42 ℃ 2 min;加入SUPER RNase H-Reverse Transcriptase 1 μl 42 ℃ 50 min;95 ℃ 5 min。按Tiangen公司PCR试剂盒说明书行PCR。PCR反应体系：cDNA 1 μl，上下游引物（10 pmol/μl）共2 μl，2×Master Mix 12.5 μl，加ddH2O至25 μl。反应程序为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min为30个循环，然后72 ℃ 5 min，取出后5 min 4 ℃电泳。SODD引物序列是：上游5’-CACAGAACCCTGGAATGACCC-3’，下游5’-CCCGAGGATTCGTACTGATGGA-3’;Survivin引物序列是：上游5’-AACCAGACCCTCATGGCTAC-3’，下游5’-TTCCCAGACTCCACTCCAAC-3’;β-actin（内参照） 引物序列是：上游5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。SODD基因产物片段为345bp，Survivin基因产物片段为157bp，内参照扩增片段为285bp。
1.3.3 免疫组织化学与结果判定 在22例肝癌及20例癌旁组织对照中，分别检测SODD与survivin蛋白的表达。常规脱蜡至水后，采用免疫组化SP法，各操作步骤按试剂盒说明书进行。苏木素复染，中性树胶封片，实验中用PBS代替一抗作为阴性对照。在高倍镜下（×200）随机选取8～10个视野，计算胞浆阳性染色细胞所占的百分数。半定量标准如下：＜10%（-），≥10％（＋）。
1.4 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件行资料的χ2检验，t检验。
2 结果
2.1 基因芯片结果 本研究通过基因芯片上的54614个探针组检测了Bel-7402、Hep-3B 2株肝癌细胞以及胎儿肝脏细胞全基因组表达情况。bcl-2、Hep-3B两株肝癌细胞与胎儿肝脏细胞相比表达共同上调2倍及2倍以上的有1452个基因；表达下调2倍及2倍以上的有2054个基因，其中与抑制细胞凋亡相关表达上调的基因有12个，见表1。表1 Bel-2、Hep-3B两株肝癌细胞与胎儿肝脏细胞相比表
2.2 RT-PCR结果 选取其中的SODD及survivin两个基因行RT-PCR验证（见图1），SODD在Hep3B、Bel7402、胎肝中与β-actin条带的灰度比值分别为1.506±0.073、1.534±0.050、0.78±0.030。survivin在Hep3B、Bel7402、胎肝中与β-actin条带的灰度比值分别为0.476±0.023、0.354±0.034、0.297±0.012，两个目的基因在肝癌细胞中的灰度比值与胎肝细胞中相比差异有显著性（P<0.05），与基因芯片的结果一致。
2.3 免疫组化结果 SODD与survivin蛋白主要表达于肝癌细胞浆，免疫组化染色见胞浆内棕黄色颗粒，阳性细胞在肝癌组织内呈弥漫分布。22例HCC中SODD阳性14例，阳性率为63.6％（见图2A），癌旁肝硬化组织中阳性3例，阳性率15％，HCC组织中SODD的阳性率显著高于癌旁肝硬化组织（P<0.05）。22例HCC中survivin阳性16例，阳性率为72.7％（见图3B），癌旁肝硬化组织中阳性2例，阳性率10％，HCC组织中Survivin的阳性率显著高于癌旁肝硬化组织（P<0.05）。
3 讨论
本研究通过基因芯片技术对Bel-7402、Hep-3B两株肝癌细胞进行全基因组检测，其与肝癌组织相比不含间质组织，因而检测结果的特异性高。Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片为Affymetrix公司生产的新型寡聚核苷酸芯片，具有高信息量、并行性、集成化等优点，可以检测超过47000种基因，是目前为止涵盖基因数目最多的芯片，能够做最全面的分析。结果表明其与胎儿肝脏细胞相比共有3506个差异表达明显的基因。我们发现其中差异表达基因数量最多的是凋亡相关基因，抑制细胞凋亡的基因表达明显上调，促进细胞凋亡的基因明显下调。随后我们对抑制细胞凋亡的基因进一步研究，选取其中2个基因SODD和survivin通过RT-PCR验证了基因芯片结果的可靠性，免疫组化证实所选基因编码蛋白在肝癌组织中的表达情况与基因芯片结果是一致的。
SODD是新近发现的一个凋亡调控基因，广泛表达于多种细胞的胞浆内，属BAG蛋白家族成员，是细胞表面死亡受体介导凋亡途径中的主要负调节蛋白。本研究证实其在肝细胞癌中表达上调。SODD能特异识别并结合于TNFR1、bcl-2、DR3及HSP /HSC70胞浆段死亡结构域。对其生物学功能，目前仅清楚在TNFR1信号途径中SODD为关键负调节蛋白，通过其DD域与TNFR1结合，当三聚体TNF与TNFR1结合后，可改变受体的分子构型，使SODD与TNFR1胞浆段很快分离，暴露出TNFR1的DD，后者进一步结合TRADD等接头分子，形成TNFR1信号复合物，启动诱导细胞凋亡的信号传导。高表达的SODD可抑制TNFR1介导的细胞凋亡；若抑制胞内SODD的表达，则无需激活TNF/TNFR1途径，即可诱导凋亡的发生［3］。本研究发现BAG蛋白家族的另一成员BAG1在肝细胞癌中表达也上调，其能够与癌基因bcl-2结合，加强bcl-2的抗凋亡作用。
survivin是凋亡抑制蛋白家族（Iinhibitors of apoptosis protein，IAP）一员，在控制细胞分裂以及抑制凋亡中均起着重要作用。survivin选择表达于结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤，通过直接或间接的抑制caspases抑制凋亡，从而促进了肿瘤细胞存活与生长。有研究表明，利用siRNA使survivin基因表达下调能够增加肿瘤细胞凋亡率，降低肿瘤细胞增殖能力，增加肿瘤细胞对各种化疗药物和放疗的敏感性［4］。其同家族成员BIRC2、BIRC3表达也增高，能够与TNF受体相关因子TRAF1及TRAF2结合，可能通过干扰ICE（白细胞介素1β转化酶，IL-1β converting enzyme）样蛋白酶的激活抑制凋亡［5～7］。
本研究表明，肝细胞癌中有众多的抑制细胞凋亡基因表达增高，通过影响TNF通路、bcl-2蛋白等多种方式共同抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖。临床上对这些基因表达的干预可以促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其增殖，发挥抗肿瘤作用［8］。应用基因芯片对肝细胞癌中抑制细胞凋亡基因的全面检测筛选有助于阐明肝细胞癌发生发展的分子机制以及可能为肝癌的诊断提供新的病理学指标。临床上通过针对肝癌的相关基因的检测和分析，必然会准确的判断出肝癌的生物学特性，以指导诊疗。对临床诊疗具有重要的意义。
（本文彩图见封三）
【参考文献】
1 Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2007.CA Cancer J Clin，2007，57（1）:43-66.
2 Zhang LH，Ji JF.Molecular profiling of hepatocellular carcinomas by cDNA microarray.World J Gastroenterol，2005，11（4）:463-468.
3 Eichholtz-Wirth H，Fritz E，Wolz L.Overexpression of the’silencer of death domain’，SODD/BAG-4，modulates both TNFR1- and CD95-dependent cell death pathways.Cancer Lett，2003，194 （1）:81-89.
4 Zaffaroni N，Pannati M,Daidone MG.Survivin as a target for new anticancer interventions.J Cell Mol Med，2005，9（2）: 360-372.
5 牛坚，钱海鑫，李向农,等.靶向IGF1R的siRNA抑制人肝癌细胞SMMC7721裸鼠移植瘤的实验研究.癌症，2007，26（7） :703-708.
6 Vendrell JA，Ghayad S，Ben-Larbi S，et al.A20/TNFAIP3，a new estrogen-regulated gene that confers tamoxifen resistance in breast cancer cells.Oncogene，2007，26 （32）:4656-4667.
7 Chng HW，Camplejohn RS，Stone MG，et al.A new role for the anti-apoptotic gene A20 in angiogenesis.Exp Cell Res，2006，312 （15）:2897-2907.
8 林菊生.基因治疗在肝癌中的应用.中华肝脏病杂志，2003，11（12）：765.
作者单位：210003 江苏南京，东南大学附属南京市第二医院