血管性痴呆动物模型的初步探讨

【关键词】  血管性痴呆动物模型 初步探讨

    Experimental  research progress  on animal  model of vascular dementia

    LIU Na，LI Ai-li.The First People’s Hospital of Zhenjiang,Zhenjiang 212002,China

    ［Abstract］ObjectiveTo make animal model of vascular dementia.MethodsThis experiment for the aged  Wistar rat carried  on the method was reformed by Pulsinelli-Brierley 4 blood vessel occlusion.ResultsThrough rats swimming the water maze and step-down test,we discovered the rat in experimental group showed a significant disfunction in learning and memory and the cell appeared the dropsy or dead in their hippocampal region.ConclusionThe aged rat is aphronesia through whole cerebral ischemia，which can create mode of vascular demented animal.

    ［Key words］vascular dementia;animal model;rat

    血管性痴呆（VD）是由一系列脑血管因素导致脑组织损害引起的痴呆综合征。患者表现为记忆及认知等功能障碍综合征，不仅严重损害患者的健康，影响患者的生命质量，也给家庭和社会带来沉重的负担。在我国11个城市流行病学调查结果发现，60岁以上人群中，VD的患病率为324/10万人口，老年性痴呆（AD）为238/10万人口，VD占各类痴呆的第一位。VD患者的平均生存时间为41个月，5年内死亡率达60％以上［1］。并且随着人类社会的老龄化，VD已是国内外医学界研究的重要课题，由于对本病的发病机制尚不十分明确，亦缺少治疗本病的特效药物，因此建立理想的VD动物模型对于探明VD的病因、病理过程以及寻找和筛选防治药物具有重要意义。大鼠较其他动物价格便宜、生存率高、繁殖快、易饲养,且其脑血管解剖和生理接近人类,因此大鼠是目前制备VD模型最适宜的动物。本实验采用高脂血症加改良的四血管阻断法制作VD模型，为VD研究提供了另一种可行的实验室方法,现介绍如下。

    1材料与方法

    1.1模型的制做

    1.1.1实验动物选择7个月左右的Wistar大鼠50只，体重300～350 g，随机选取30只大鼠为实验组，用高脂饲料喂养10  d，造成高脂血症模型，从确诊为高脂血症的大鼠中随机选用大鼠20只，随机分8 d组和12 d组各10只；其余20只为对照组（8 d组和12 d组各10只）。

    1.1.2主要仪器设备大鼠跳台试验装置及水迷宫试验装置由中国医学科学院药物研究所制造。

    1.1.3痴呆动物模型标本的制作采用Pulsinelli-Brierley 4血管阻塞法进行改良，具体步骤如下：将高脂血症大鼠用10％水合氯醛(0.3 ml/mg体重)腹腔麻醉后，沿背侧正中切开，暴露出双侧第一颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm的电凝针灼烧在翼小孔中走行的椎动脉，造成永久性闭塞；24 h后，大鼠取仰卧位固定，沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，然后用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，每次5 min，共夹闭3次，每次间隔5 min，此为脑缺血期，25 min后结束夹闭颈总动脉为再灌注期。大鼠术中均保证有自主呼吸，术后放回笼中常规饲养观察。对照组大鼠不做椎动脉电凝和颈总动脉断流，其余过程与实验组相同。

    1.2大鼠学习、记忆测试方法

    1.2.1水迷宫方法采用中国科学院药物所研制的水迷宫，水迷宫由半透明有机玻璃制成(80 cm×50 cm×21 cm)，其有4个盲端，终点处有一个高出水面的安全台。放水深23.0 cm，水温22 ℃～28 ℃，并保持各处水温均匀，水无色澄清，水迷宫周围的空间标志在实验过程中保持不变［2］。制备模型前令对照8 d、12 d组，再灌注8 d、12 d组大鼠学会游水迷宫，学会游水迷宫标准：沿正确路线从起点到达终点，并能连续3次到达这个标准，每次所需时间不超过2 min。

    1.2.2跳台方法跳台装置为60 cm×12 cm×33 cm的被动回避反应箱，四周用黑色塑料板分隔，箱底为可通电的铜栅，反应箱的右后角放置一直径和高均为4.0 cm的绝缘橡皮垫，作为大鼠回避电击的安全台，由调压器调节电压提供交流电。实验时，将大鼠放入此装置中适应5 min然后立刻通以40 V交流电，动物受电击后,其正常反应是跳到安全台躲避电击，其跳到安全台前受电击的次数为错误次数［3］。

    1.3形态学观察灌注和切片：各组大鼠在完成实验当天（再灌注8 d、12 d）给予腹腔麻醉(戊巴比妥钠30 mg/100 g体重)，暴露心脏，剪开右心耳，在左心室插管，先用200 ml生理盐水灌冲，然后4％多聚甲醛溶液(PBS、0.1 mol/L、pH 7.4)灌注后，取出脑组织，将其浸于相同甲醛液中48 h后，常规漂洗、脱水，石蜡包埋，连续切片，备HE、免疫组化染色使用。

    1.4观察指标（1）对照8 d、12 d组，缺血再灌注8 d、12 d组大鼠术前术后游水迷宫5 min入盲端错误次数及游全程所需时间。（2）对照8 d、12 d组，缺血再灌注8 d、12 d组大鼠术前术后通电5 min内错误次数及受电击时间。（3）光镜观察大鼠脑组织缺血前后形态学变化。

    1.5统计学分析各组试验数据以均数±标准差（x±s）表示,应用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析(两两比较采用LSD)进行统计学处理。

    2结果

    2.1大鼠游水迷宫的学习、记忆巩固成绩

    2.1.1大鼠全脑缺血前游水迷宫结果术前对照8 d组与再灌注8 d组大鼠游水迷宫5 min入盲端的错误次数分别为7.40±0.55及7.00±1.23，经统计学处理差异不明显(P>0.05)；术前对照8 d组与再灌注8 d组大鼠游完水迷宫全程所需时间分别为（128.20±8.98）s及(131.80±13.16)s，经检验差异无统计学意义(P>0.05)。术前对照12 d组与再灌注12 d组大鼠游水迷宫5 min入盲端的错误次数分别为（7.20±0.84）次及（7.20±1.10）次，经统计学处理差异不明显(P>0.05)；术前对照12 d组与再灌注12 d组大鼠游完水迷宫全程所需时间分别为（126.40±10.50）s及(119.80±14.36)s，经检验无显著差异(P>0.05)，见表1。

    2.1.2大鼠全脑缺血后游水迷宫结果术后8 d，对照8 d组与缺血再灌注8 d组大鼠游水迷宫5 min入盲端的错误次数分别为4.00±0.71及13.00±1.41，经统计学处理差异有统计学意义(P<0.05)；对照8 d组与再灌注8 d组大鼠游完水迷宫全程所需时间分别为(74.20±9.55)s及(325.20±14.13)s，经检验差异显著有统计学意义(P<0.01)。术后12 d，对照12 d组与再灌注12 d组大鼠游水迷宫5 min入盲端的错误次数分别为5.20±0.84及14.40±1.14，经检验差异有统计学意义(P<0.05)；对照B组与再灌注12 d组大鼠游完水迷宫全程所需时间分别为（85.40±8.29）s及(370.20±36.09)s，经检验差异显著有统计学意义(P<0.01)，见表1。表1全脑缺血再灌注前后大鼠游水迷宫学习、记忆成绩

    2.2.1大鼠全脑缺血前跳台实验结果术前对照8 d组与再灌注8 d组大鼠跳台试验5min错误次数分别为0.74±0.40及0.80±0.42，经统计学处理差异不明显(P>0.05)；术前对照8 d组与再灌注8 d组5 min内受电击的时间别为（0.92±0.60）s及(0.90±0.58)s，经检验无显著差异(P>0.05)。术前对照12 d组与再灌注12 d组大鼠跳台试验5 min错误次数分别为0.72±0.38及0.78±0.44，经统计学处理差异不明显(P>0.05)；术前对照12 d组与再灌注12 d组5 min内受电击的时间别为（0.94±0.61）s及(0.93±0.63)s，经检验无显著差异(P>0.05)，见表2。

    2.2.2大鼠全脑缺血后跳台试验结果术后对照8 d组与再灌注8 d组大鼠跳台试验5 min错误次数分别为0.38±0.23及2.98±1.42，经统计学处理差异显著(P<0.05)；术后对照8 d组与再灌注8 d组5 min内受电击的时间别为（0.68±0.34）s及(12.06±2.46)s，经检验差异非常显著(P<0.01)。术后对照12 d组与再灌注12 d组大鼠跳台试验5 min错误次数分别为0.40±0.24及3.20±1.65，经统计学处理差异显著(P<0.05)；术后对照12 d组与再灌注12 d组5min内受电击的时间别为(0.64±0.32)s及(18.10±3.24)s，经检验差异非常显著(P<0.01)。见表2。表2全脑缺血再灌注前后大鼠跳台实验成绩注：与对照组比较，★P>0.05，*P<0.05，**P<0.01

    2.3HE染色对照组：细胞排列致密、整齐，边界清楚，胞浆被染成淡红色，胞核圆形或椭圆形，呈蓝色，胞核轮廓清楚，未见缺血损伤。缺血再灌注8 d组：出现明显水肿，细胞排列不整齐，胞浆呈嗜酸性，胞核固缩。缺血再灌注12 d组：细胞排列紊乱，细胞坏死，并见胶质细胞增生。

    3讨论

近年来由于脑血管病造成的各种功能和智能障碍日益严重，因此血管性痴呆的防治日益受到人们的重视。建立一个重复性强、稳定性高的动物模型有助于研究VD的发病机制、病理学特点、生化改变及有助于检验药物疗效等。本实验选用高脂血症老年鼠避免了年龄错配，其更接近老年人血管生理病理改变，青年大鼠对脑缺血有一定的代偿及修复能力，随着脑缺血的时间延长，这种代偿能力发挥作用，在治疗痴呆新药研发中易出现假阳性结果，这在防治VD的药物开发研究中尤为重要［3］。本实验的VD模型在较短时间内出现智能障碍，如果像某些方法长时间等待智能障碍的出现，对于中老年鼠来说，很难说这个智能障碍是模型制造的结果，还是时间推移动物进一步老化的结果，这个改变与人类VD的病理生理过程相差很远，而且长时间的饲养，造成动物死亡率升高，影响统计结果的可靠性。本实验在原来Pulsinelli-Brierley 4血管阻塞法上进行改良，采用间断阻断血流，避免了加紧动脉夹后全脑缺血时间过长，造成动物死亡，降低了死亡率。为了评估阻断后脑组织的灌注情况，任飞等向大鼠心内注入了染料美蓝，发现分别阻断颈动脉和椎动脉后，脑组织仍有较深的蓝染，但是同时阻断四血管，大脑半球脑组织着色明显减轻，但嗅球和小脑着色仍很深，嗅球血供来源不清楚，小脑和脑干可能由脊髓前动脉供血。此模型脑干无损伤或损伤轻微，大鼠呼吸、循环基本不受影响，这些情况与Willams观察的情况基本相同。本模型对大鼠脑内神经元造成严重损害，其损伤机制包括缺血缺氧引起的细胞变性坏死以及细胞凋亡等［4］。这种模型缺血损伤肯定，神经元损伤的比例稳定［5］，并且海马组织损伤明显，可显示记忆功能的减退［6］。本实验研究结果显示实验组大鼠游水迷宫入盲端的错误数增加，游完水迷宫全程所需时间延长，这说明老龄大鼠经过全脑缺血再灌注损伤后，记忆巩固能力受到严重损害，产生了血管性痴呆结果。这种技术高度模拟VD的发病特点，其制作过程与VD的发病机制相接近，生理指标稳定，无明显肢体运动障碍，故其稳定性高、重复性强，效果确切。有广泛推广价值。

【参考文献】
  1Bomebroke M,Breteler NM.Epidemiology of non-AD dementias.Clin Neurosic Research，2004,3(6):349-361.

2陈新梅，朱家璧，孙卫东，等.用药效学指标筛选人参皂苷Rg1鼻用制剂的促吸收剂.中国天然药物，2005，6(3)：362-364.

3蔡晶，杜建.血管性痴呆动物模型的制作方法及其评价.中医药学刊，2002,5(20)：517-519.

4高东，王景周，姚恩国，等.海马及皮层神经元的丢失与血管性痴呆发病机制的实验研究.中国行为医学科学，2002，11(3)：251-254.

5Willams A.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke,2007,10(3):267-272.

6Nitatori T,Sato N,Waguri S,et al.Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the cerebral hippocampus following transient ischemia is apoptosis.J Neuosci,1995,15(2): 1001-1011.

作者单位：1212002 江苏镇江，镇江市第一人民医院