点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨胃癌患者腹腔冲洗液中游离癌细胞的检测及其临床意义。方法 用扩增CEAmRNA的巢式RT-PCR方法检测42例胃癌患者胃切除手术前后腹腔冲洗液中游离癌细胞。结果 （1）胃癌组织中CEAmRNA表达均阳性，而非癌患者腹腔冲洗液、间皮细胞及健康人血细胞样本中CEAmRNA表达均阴性;（2）用胃癌细胞梯度稀释标本进行巢式RT-PCR检测CEAmRNA，发现其检测敏感性达到1/10 5 ，（3）42例胃癌患者中，胃切除手术前后分别有16例（38.1%）和19例（45.2%）患者腹腔冲洗液中游离癌细胞阳性;（4）胃切除手术前腹腔冲洗液中游离癌细胞阳性与肿瘤浸润深度、TNM分期密切相关（P<0.05）。结论 （1）扩增CEAmRNA的巢式RT-PCR方法是检测胃癌患者腹腔冲洗液中游离癌细胞的敏感而特异的方法;（2）检测胃癌患者腹腔内游离癌细胞有助于判断肿瘤进展程度;（3）手术操作可能促进癌细胞的腹腔内播散。
Xia Jiazeng，Li Jianping，Zhou Hong，et al.
Department of General Surgery，Wuxi Second People’s Hospital，Jiangsu214002.
【Abstract】 Objective To study the detection of free cancer cells in abdominal washings of patients with gastic carcinomas and its clinical significance.Methods Pre-and post-operative abdominal washings in42cases of patients with gastric carcinomas were detected for free cancer cells by nested RT-PCR amplification for CEAmRNA.Results （1）CEAmRNA was expressed in all gastric cancer tissues but not in abdominal washings of noncancer patients or in mesothelial cells and peripheral blood of healthy individuals;（2）Sensitivity of nested RT-PCR amplification for CEAmˉRNA was confirmed to be1/10 5 by serial dilusion method using human gastric cancer cell;（3）In42patients with gastric carcinomas，pre-and post-operative abdominal washings were detected with free cancer cells in16（38.1%）and19（45.2%）patients，respectively;（4）Positive rate of free cancer cells in pre-operative abdominal washings significantly correlated with depth of invasion and TNM stage（P<0.05）.Conclusion （1）Nested RT-PCR amplification for CEAmRNA is a sensitive and specific method for the detection of free cancer cells in abdominal washings in gastric carciˉnomas;（2）Detection of free cancer cells in abdominal washings in patients with gastric carcinomas may be helpful to deˉtermine tumor progression;（3）Surgical manipulation can provoke intraperitoneal dissemination of cancer cells in patients with gastric carcinomas.
Key words gastric carcinomas abdominal washings nested RT-PCR
近年来胃癌的治疗虽取得一定进展，但进展期胃癌的总体疗效并不理想。据报道，侵犯到浆膜的胃癌，即使施行了根治术，5年生存率仍不足35% ［1］ 。腹膜播散是胃癌最常见的复发类型，大约30%～50%的进展期胃癌在根治术后发生腹膜转移，并是这些患者的主要死因。
自浆膜侵犯部位脱落的肿瘤细胞是胃癌腹膜播散及随后发生的腹膜转移的指征之一，用细胞学方法检测胃癌患者腹腔冲洗液中游离癌细胞对了解肿瘤进展和判断预后有一定意义 ［2］ 。但常规细胞学方法的敏感性较低，即使细胞学阴性的患者也可能发生腹膜转移，因此其应用受到质疑 ［2］ 。
RT-PCR方法是近年来发展起来的新技术，利用组织特异基因的mRNA作标记物，已成功地用于淋巴结、骨髓、周围静脉血中微转移的检测，敏感性可达1/10 6 ～1/10 7 。本研究中，我们以CEAmRNA作标记物，用巢式RT-PCR方法检测胃癌患者术中胃切除前后腹腔冲洗液中游离癌细胞，并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 临床病理资料 42例胃癌患者，男24例，女18例。年龄3l～82岁，平均59.7岁。其中早期胃癌8例，进展期胃癌34例。所有患者均行胃大部切除或全胃切除加淋巴结切除术，术前未接受放疗和化疗。
1.2 研究方法
1.2.1 腹腔冲洗及标本采集 手术中打开患者腹腔，在胃切除手术前以及胃切除手术后，分别吸取腹水或用500ml生理盐水冲洗腹腔，轻轻搅动后吸取膈下及Douglas窝积液，2000rpm离心10min，细胞成分用PBS淋洗后，再次离心，收集细胞成分用于抽提总RNA。
1.2.2 总RNA抽提和巢式RT-PCR方法检测CEAmRNA:总RNA抽提和RT-PCR扩增均采用Promega公司试剂盒，按说明书进行操作。引物按Gerhard等 ［3］ 的设计，由GIBCO公司合成，序列为:A（outer sense）:5’-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCA;GCTGG-3’;B（antisense）:5’-TGTAGCTGTTGˉCAAATGCTTTAAGGAAG;AAGC-3’;C（inner sense）:5’-GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG-3’;第一轮扩增使用引物A和引物B，第二轮扩增使用引物C和引物B;两轮反应均进行30次循环，94℃变性2min，72℃退火和延伸2min30s;第一轮扩增产物为160bp，第二轮扩增产物为132bp。每次实验均同时进行管家基因GAPDHmRNA的RT-PCR扩增以作内参照，方法参照Mori等 ［4］ 的报道，所用引物序列为:sense:5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3’;anˉtisense:5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’;扩增产物为540bp，GAPDHmRNA阳性的样本视为有效样本。每次实验均进行不作逆转录的扩增和不含RNA样本的扩增作为阴性对照，以排除由于样本受基因组DNA污染或受前次扩增产物污染而导致的假阳性;另外，每次实验同时用人胃癌SGC-7901细胞RNA样本作阳性对照，以排除因反应体系或反应条件错误而导致的假阴性。所有PCR扩增产物均用1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，另取阳性产物进行测序鉴定。
1.2.3 特异性试验和敏感性试验 （1）特异性试验:选取6例胃癌组织、6例非癌患者术中腹腔冲洗液样本，分别抽提总RNA，作巢式RT-PCR检测CEAmRNA的表达。另外，由于间皮细胞和血液细胞是腹腔冲洗液的主要成分，我们取3例间皮细胞样 本（原代培养人间皮细胞是自胃癌患者大网膜标本分离）和3例健康人周围静脉血样本，分别抽提总RNA，做巢式RT-PCR检测CEAmRNA表达。（2）敏感性试验:在显微镜下用四格表法计数人胃癌SGC-7901细胞，并用健康人周围静脉血中单核细胞进行梯度稀释，使胃癌细胞与单核细胞的比例依次为1/1、1/10、1/10 2 、1/10 3 、1/10 4 、1/10 5 ，按前述方法检测CEAmRNA表达。
1.3 统计学分析 胃切除前后腹腔内游离癌细胞阳性率比较用两样本率差异的显著性检验，胃切除前腹腔冲洗液中游离癌细胞阳性与临床病理因素之间的关系采用χ 2 检验或确切概率法，P<0.05为有显著性差异的标准。
2 结果
2.1 巢式RT-PCR方法检测CEAmRNA的特异性和敏感性 从6例胃癌组织中抽提的总RNA进行巢式RT-PCR扩增，CEAmRNA表达均为阳性，所有样本均有132bp片段产生;而从6例非癌患者术中腹腔冲洗液样本抽提的总RNA进行巢式RT-PCR扩增，CEAmRNA表达均为阴性。3例间皮细胞和3例健康人周围静脉血样本中CEAmRNA表达亦为阴性。总RNA样本用RT-PCR方法检测管家基因GAPDHmRNA的表达均为阳性，凝胶电泳分析均有540bp片段产生，说明用于巢式RT-PCR检测的总RNA样本完整。
在各种稀释梯度的胃癌细胞/单核细胞样本中，巢式RT-PCR方法均能检测出CEAmRNA的表达，表明应用本方法检测癌细胞的敏感性可达1/10 5 。
2.2 胃癌切除手术前后腹腔冲洗液中游离癌细胞的检测结果 42例胃癌患者胃切除手术前腹腔冲洗液标本经巢式RT-PCR检测，有16例（38.1%）CEAmRNA表达阳性;胃切除手术后腹腔冲洗液标本经巢式RT-PCR方法检测，有19例（45.2%）CEAmˉRNA表达阳性。胃切除手术前检测阳性的16例患者在胃切除手术后再次冲洗腹腔仍能检测出CEAmˉRNA，胃切除手术前检测阴性的26例患者中，胃切除手术后再次冲洗腹腔也有3例检测出CEAmRNA，但统计学分析表明，胃切除手术前后腹腔冲洗液中CEAmRNA检出率差异无显著性（P>0.05）。取巢式RT-PCR检测阳性产物进行测序鉴定，所得序列与GenBank所提供的序列完全一致。
2.3 胃切除手术前腹腔冲洗液中游离癌细胞的检测与临床病理因素的关系 胃切除手术前腹腔冲洗液中游离癌细胞阳性与肿瘤大小、Borrmann分型、组织分化程度及Lauren分型无明显相关性，但与肿瘤浸润深度及肿瘤TNM分期密切相关，浸润越深、临 床TNM分期越晚的肿瘤，腹腔内游离癌细胞阳性率越高（见表1）。
表1 胃切除前腹腔游离癌细胞与临床病理因素的关系 （略）
注: ˇ NS:差异无显著性
3 讨论
胃癌的转移途径主要有血液转移、淋巴转移和腹腔内种植3个途径。淋巴结转移一直受到广泛重视，大量研究表明，转移淋巴结数量和解剖范围是胃癌的重要预后因素并被纳入TNM分期范畴 ［1］ 。血源性转移也受到重视，有研究发现，周围静脉血或骨髓中微转移癌细胞阳性与肿瘤不良预后密切相关。实际上，对于胃癌而言，腹膜播散也是影响预后的重要因素。东西方国家的资料均显示，腹膜播散是胃癌术后最常见的转移和复发方式 ［5～6］ ，但腹膜转移的早期诊断极为困难。尽管近年来在影像诊断学如超声、CT、MRI等方面有迅速进步，但对腹膜播散的早期非侵入性诊断仍不可能。早期人们用细胞学方法检测腹腔内游离癌细胞，并发现阳性结果与不良预后密切相关 ［5］ ，但细胞学方法的敏感性和特异性均较低，因此其结果受到质疑。
随着分子生物学的发展，RT-PCR方法已被成功用于检测各种临床标本中微量癌细胞，如用CKl9和CEA作为标记基因的RT-PCR检测胃癌淋巴结微转移，证明是一种高度敏感的方法。本研究中我们用巢式RT-PCR方法检测胃癌患者腹腔冲洗液中游离癌细胞。由于间皮细胞是腹腔冲洗液中的一种主要细胞成分，表达CKl9，因此我们用CEA作为标记基因，在各种类型的胃癌细胞系中均有CEA基因表达。但白细胞也表达一系列CEA相关基因，而腹腔冲洗液中含有白细胞，也可能导致假阳性 ［7］ ，因此我们在实验中将退火温度提高到72℃，同时采用位于不同外显子上的引物，以增加检测特异性。研究结果发现，6例胃癌组织标本均有CEAmRNA表达，而非癌患者腹腔冲洗液和健康人外周血标本以及间皮细胞中均无CEAmRNA表达。虽然提高退火温度可降低检测敏感性，但我们用肿瘤细胞梯度稀释标本进行巢式RT-PCR检测，发现其检测敏感性达到1/10 5 ，表明这一方法检测CEAmRNA表达具有高度的特异性和敏感性。
在42例胃癌患者中，胃切除手术前腹腔冲洗液标本经巢式RT-PCR检测发现16例（38.1%）有CEAmRNA表达，胃切除手术后腹腔冲洗液标本经巢式RT-PCR检测发现19例（45.2%）有CEAmRNA表达。16例胃切除手术前检测阳性的患者，胃切除手术后检测仍为阳性，26例胃切除手术前检测阴性的患者，有3例在胃切除手术后检测为阳性，说明手术操作本身也可引起腹膜播散，其原因可能是:（1）手术过程中切断了肿瘤引流途径的淋巴管或静脉血管或切开转移淋巴结;（2）手术操作中挤压或摩擦导致浸润到浆膜的肿瘤细胞直接脱落;（3）切开胃肠壁致使含癌细胞的消化液外流;（4）切除不彻底、切缘阳性，致使肿瘤细胞残留 ［8］ 。虽然手术前后样本的阳性率没有显著性差异，但这一发现对胃癌的治疗仍具有重要的指导意义，以胃切除手术后腹腔冲洗液内游离癌细胞阳性作为腹腔内温热灌注化疗（inˉtraperitoneal perfusive hyperthermical chemotherapy，IPHC）的适应证，将会明显改善胃癌患者的预后。我们的结果表明，胃切除手术前腹腔冲洗液中游离癌细胞阳性与肿瘤大小、Borrmann分型和Lauˉren分型及组织分化程度无关，但与肿瘤浸润深度和TNM分期密切相关，随着浸润加深和分期增加，游离癌细胞阳性率也明显增加，检测腹腔内游离癌细胞对了解肿瘤进展程度和判断预后有重要指导意义。值得注意的是，在20例未侵犯到浆膜层的肿瘤中也有4例检测到腹腔内游离癌细胞，甚至有1例仅侵犯到粘膜下层，这些患者腹腔内游离癌细胞可能是从转移淋巴结被膜上脱落的。此前也有报道，大约l%的早期胃癌在根治术后发生腹膜转移 ［9］ ，因此早期胃癌的腹膜播散也是不容忽视的问题。当然，侵犯到浆膜层的肿瘤也并不都会发生腹膜播散，本组22例侵犯到浆膜层或侵犯到邻近器官的肿瘤，有10例未检测到腹腔内游离癌细胞，可能是由于肿瘤细胞缺乏粘附分子如CD44、β 1 整合素等的表达，因此在到达浆膜面后不能粘附于腹膜而很快死亡 ［10］ 。据研究，对癌肿已转移至腹膜或术后腹膜复发的晚期胃癌患者，施行积极的去肿瘤负荷手术，并辅以IPHC疗法，可显著提高患者5年生存率 ［11，12］ 。腹腔内预防性使用化疗药也可防止腹膜复发 ［13］ 。因此，采用敏感的RT-PCR方法检测胃癌患者腹腔内游离癌细胞，选择阳性患者进行积极的治疗对预防腹膜复发和改善预后将会产生积极的影响。
参考文献
1 Kodera H，Yamamura Y，Torii A，et al.Postoperative staging of gastricˉcancer:a comparison between the UICC Stage Classification and the12 thedition of the General Rules for Gastric Cancer Study.Scand J Gastroenˉ terol，1996，31:476-480.
2 Wu CC，Chen JT，Chao MC，et al.Optimal surgical strategy for potenˉtially curable serosa-involved gastric carcinoma with intraperitoneal free cancer cells.J Amer Coll Surg，1997，184:611-617.
3 Gerhard M，Juhi H，Kalthoff H，et al.Specific detection of carcinoembryˉonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polyˉmerase chain reaction.J Clin Oncol，1994，12:725-729.
4 Mori M，Mimori K，Ueo H，et al.Clinical significance of molecular deˉtection of carcinoma cells in lymph nodes and peripheral blood by reverse transcription-polymerase chain reaction in patients with gastrointestinal or breast carcinomas.J Clin Onco，1998，16:128-131.
5 Boku T，Nakane Y，Minoura H，et al.Prognostic significance of serosal invasion and free intraperitoneal cancer cells in gastric cancer.Bri J Canˉcer，1990，77:436-439.
6 Kodera Y，Nakanishi H，Yamamura Y，et al.Prognostic value and cliniˉcal implications of disseminated cancer cells in the peritoneal cavity deˉtected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and cyclogy.lnt J Cancer，1998，79:429-433.
7 Kodera Y，Isobe K，Yamauchi M，et al.Expression of carcinoembryonic antigen（CEA）and nonspecific cross-reacting antigen（NCA）in gasˉtrointestinal cancer:the correlation with degree of differentiation.Bri J Cancer，1993，68:130-136.
8 Sugarbaker PH.Observations concerning cancer spread within the periˉtoneal cavity and concepts supporting an ordered pathophysiology in Periˉtoneal Carcinomatosis:Principles of Management Sugarbaker PH edited.Kluwer Academic Publishers，1996，79-100.
9 Sano T，Sasak M，Kinoshita T，et al.Recurrence of early gastric cancer follow up1475patients and review of the Japanese literature.Cancer，1993，72:3174-3178.
10 Nakashio T，Narita T，Akiyama S，et al.Adhesion of human gastric and pancreatic cancer cells to peritoneal mesothelial cells is mediated by CD44andβ1integrin.Int J Onco1，1997，10:183-188.
11 Yonemura Y，Fujimura T，Fushida S，et al.Hyperthermochemotherapy combined with cytoreductive surgery for the treatment of gastric cancer with peritoneal dissemination.World J Surg，1991，15:530-536.
12 Yonemura Y，Ninomiya I，Kaji M，et al.Priphylaxis with intraoperative chemohyperthemia against peritoneal recurrence of serosal invasion-posiˉtive gastric cancer.World J Surg，1995，19:450-455.
13 Hagiwara A，Takahashi T，Kojima O，et al.Prophylaxis with carbon-abˉsorbed mitomycin against peritoneal recurrence of gastric cancer.Lancet，1992，339:629-631.
（收稿日期:2004-08-24）
作者单位:214002江苏省无锡市第二人民医院
200025上海第二医科大学瑞金医院普外科
（编辑江 风）