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基因治疗是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。近几年来泌尿外科领域里，某些肾脏疾病的基因治疗有了相当大的发展、在一些临床试验中获得确切的成功。在临床上进展最快应用最多是肾癌的基因治疗，目前还仅限于晚期癌。在肾脏基因表达仅限于肾脏本身，其合成的蛋白产物主要集中于肾脏局部，因此肾脏是理想的基因治疗的靶器官。
1 肾脏靶细胞的基因转移方法
肾脏是高度分化的器官，组成包括有肾小球、肾小管、脉管系统和间质组织，由基底膜和相关细胞所分隔。肾小球基底膜把尿液从血液中分离出来，肾小管基底膜把水分从原尿中重吸收来。基因载体较难通过这些解剖上的屏障，这使基因转染存在困难。目前有4种途径将基因转移给肾脏:动脉途经、静脉途径、输尿管途径、肾实质直接注射途径。
1.1 病毒载体系统
1.1.1 逆转录病毒载体 半数人类基因治疗的载体是复制缺陷型的逆转录病毒，属RNA病毒。其所含的gag、pol、和env3个基因已被目的基因所取代，不能在细胞内自主复制，但仍具有转染细胞的能力，随机地整合到宿主的基因组中，理论上讲其转染基因可以长期表达。但由于整合基因中DNA的甲基化，有时转染基因在体内的表达不过8～10周 ［1］ 。逆转录病毒只能在细胞处于分裂期的时侯才能稳定地整合到宿主基因组中，而肾脏细胞有丝分裂率低，这样逆转录病毒载体基因对肾细胞的转染率就比较低。Boschdeng尝试通过叶酸损伤肾小管细胞后的修复机制来促使细胞增殖 ［2］ 。虽然有一定效果，但基因转染率还是比较低，只能在注射的局部表达。
1.1.2 腺病毒载体 腺病毒是一种双链DNA病毒，它能寄生的宿主广泛。在人类主要存在于上呼吸道，一般情况下不致病。其缺陷在于不能整合到染色体上，因而随着细胞的分裂可能丢失。另一主要缺陷是病毒编码蛋白可以激发机体的免疫反应，使病毒载体很快被清除，同时可引起严重的过敏反应。据报道有6种将目的基因腺病毒载体导入靶细胞的途径。Moullier等，首先报道了向肾动脉注射腺病毒载体，使近端小管细胞出现低度基因转染及通过逆行注射将腺病毒载体引向肾盂，后者选择性地使乳头、髓质区的集合系统细胞出现基因转移 ［3］ 。Takase等向肾动脉注射腺病毒载体后夹闭肾动脉，观察到皮质近端小管细胞表达B-半乳糖激酶 ［4］。Ye等报道以肾小球内皮细胞为靶细胞，向肾动脉灌注高滴定度的腺病毒载体，其目的基因表达持续了3周 ［5］。Ortiz PA等直接向外层皮质注射含有编码GFP（荧光绿蛋白）基因的腺病毒载体，观察到在注射部位周围细胞表达的GFP ［6］ 。现在还不清楚为什么注射方式不同能引起目的基因表达方式的不同。
1.1.3 腺相关病毒载体（AAV） 是一种广泛寄生于人体的非致病病毒，为单链DNA。大部分基因可被替代而保留感染能力，能感染处于不同周期的细胞，定点整合到人类的第19号染色体的短臂上。其缺陷为目前尚无包装细胞，体外滴度低 ［7］ 。AAV在骨骼肌上的表达时间可达32周以上。Lipkowitz等报道了将含有LacZ基因的AAV载体注射到肾实质中，结果发现LacZ基因在靠近注射部位的肾小管内皮细胞有表达而在肾小球和脉管系统则无表达 ［8］ 。Chen等的研究也获得同样的结果 ［9］ 。至今为止，AAV载体的体内靶细胞似乎只限于肾小管集合系统。
1.2 物理/化学基因导入法
1.2.1 裸露DNA直接注射和液体静力进样法 最简单的基因载体是质粒，除了对骨骼肌外，它的转导率通常很低。流体静力进样法:含有裸露DNA的大剂量溶液从末梢静脉注入，对肝脏细胞的转导率很高。Maruyama等在15s内向小鼠静脉注射含有质粒载体的25ml大剂量溶液，其质粒含有编码Epo的基因。他们观察到在小鼠的肝脏有Epo mRˉNA表达 ［10］ 。流体静力进样法应用于肾脏，还处于试验研究阶段。Maruyama等在夹闭肾动静脉后，于5s内向肾脏注射1ml溶液、含100μg质粒栽体。其主要进入间质中的成纤维细胞，基因表达可持续24周［11］ 。
1.2.2 脂质体共转导 本法用于体外细胞时，转导率较高。也可用来与DNA直接注射到肿瘤，但转导率低，一般很少将这种方法用于肾脏。Maeshima等使用了一种复合脂质体，其表面对肾小球的系膜细胞有牢固的亲合力 ［12］ 。由于脂质体在体内可以降解，对机体无害，也没有免疫原性，不会导致炎症。目前正在致力于开发转导率更高、组织/细胞特异性更强或能在体内长期循环的脂质体复合物 ［13］ 。
1.2.3 电穿孔基因转移技术 是外源性基因转移的最有效的一种非病毒载体方法。利用高压脉冲电场在细胞膜上形成纳米级微孔，提高细胞膜对外源性DNA的通透性，DNA分子直接通过这些微孔或当微孔闭合时伴随膜成分重新分布进入细胞质中。该法操作简便易行，基因转移效率很高。在电穿孔基因转移技术中，以骨骼肌肌细胞作为体内基因转移的靶细胞，一直成为主要试验研究方向。Tsujie等研究人员们开发出一种新的将外源性基因导入肾脏的技术。在将肾动静脉夹闭后，向肾脏注入0.5ml的含有质粒DNA的溶液，再给肾脏加以75V电压，其电脉冲频率为6次/50ms。他们观察到75%的肾小球有转移基因表达 ［14］ 。这是一种向肾小球系膜细胞及成纤维细胞转移外源性基因最可靠、最有效的方法。
1.2.4 超声基因转移技术 超声作用下微气泡破裂，其产生的作用力可将质粒导入毛细血管的内皮细胞和间质中的成纤维细胞以及肾小球细胞。已有试验在超声微气泡系统作用下将质粒DNA转移到小鼠的肾脏，没有在小鼠身上发现形态及功能上的副作用 ［15］ 。
2 肾癌的基因治疗
2.1 一般方法 肾细胞癌（RCC）病人的20%～30%有转移病灶，这些有转移病灶的病人平均生存期为6～8个月 ［16］ 。这些病人用其它治疗方法效果很差，伦理学问题较少，目前基因治疗主要针对于这些晚期病人。最令学者感兴趣的是其中一小部分病人具有颇具戏剧性的病程变化 ［17］ 。Oliver等观察了74例有转移病灶而未经治疗的晚期病人的自然病程。在这些病例中有4%的病人完全自然缓解，3%的病人部分自然缓解。5%的病人1年内病情无变化。此外，尚有些病人诊断为未转移癌，行肾癌根治术十几年后发现有转移灶出现 ［18］。因此推测后者在实施根治术时已出现微转移灶，在临床发现以前一直被免疫系统监视控制着，以微小病灶状态存在。上述病例虽属少数情况，但可以看出免疫系统对肾癌的病程及预后有决定性的影响。RCC是少数几种对免疫治疗最为敏感的肿瘤之一，IL-2和干扰素α是目前肾癌的标准治疗药物。对癌灶无直接药理作用，但能激活刺激免疫系统。全身副作用大。病人有效率一般为15%～20% ［19］ 。目前的临床Ⅰ/Ⅱ期基因治疗试验是将IL-2基因作为目的基因导入肿瘤细胞来激活细胞毒T淋巴细胞 ［20］ 。在这项试验中将包含IL-2基因的质粒载体直接注射进肿瘤瘤体内，结果14%的病人的肿瘤体积缩小。
免疫基因治疗策略是目前最主要的肾癌基因治疗方法。主要问题是缺乏有效的肿瘤抗原，难以制成有效的肿瘤疫苗。最近碳酸脱水酶（CA9）被认定是—种能用于肿瘤免疫治疗的抗原蛋白。CA9特异性地出现于80%的肾癌组织中，表达于95%～100%的肾癌细胞中 ［21］ 。
“自杀”基因的基因治疗也是一种常见的肿瘤基因治疗方法。在最近的RCC研究中，有人将“自杀”基因HSK-TK转染至肿瘤组织，使肿瘤细胞成为表达HSK-TK的细胞，能将前体药物ACV或GCV转化为对分裂细胞有杀伤作用的代谢产物，特异性地杀伤肾肿瘤细胞 ［22］ 。在种植人类肾癌细胞的小鼠身上，将以腺病毒为载体的HSV-TK基因直接注射到瘤体内，5d后开始给实验小鼠注射GCV，疗程为15d。观察到所有接受实验治疗的小鼠生存期延长、瘤负荷降低。
2.2 治疗现状 Galanis等报道了一种方法，将一种带有阴离子的脂溶性的注射剂，其中溶有带有IL-2基因的质粒，直接注射到肿瘤瘤体。他们共治疗14例肾癌病人，其中2例肿瘤体积略有减小，另有2例体积缩小25%以上 ［23］ 。Schmidt-Wolf等也报道了通过免疫基因治疗晚期癌的临床病例，在体外将IL-2基因转染给病人自体类NK的T细胞。报道中没有提到将治疗对象分组分类，但病例中包括1例进展期肾癌，8例有远处转移的结肠癌。其中6例病人治疗后，病情仍有进展，3例病人治疗后病灶停止发展，说明该治疗对部分病人有效。由于使用非病毒载体系统的免疫基因治疗能减少肾肿瘤的瘤负荷，对于其在临床上的试验，—般持积极态度 ［24］ 。
Wittig等介绍了一种通过IL-7和GM-CSF基因转染给肿瘤细胞而行成疫苗的免疫疗法。经过基因修饰的能够表达IL-7和GM-CSF的自体肿瘤细胞进入人体后，不仅能够表达修饰产物，同时作为瘤细胞疫苗在一些晚期肾癌转移病人中包括瘤体较大者，可刺激其机体产生强烈的免疫应答 ［25］ 。据报道在日本已应用GM-CSF基因作为目的基因来治疗RCC取得了进展，已观察到1例病人肿瘤的消退 ［26］ 。
3 问题与展望
基因治疗应用于肾脏疾病时存在着一些特殊问题:（1）肾脏各相关结构和功能的保护。（2）肾脏的大部分细胞处于分裂间期，基因转染率低。（3）基因转入肾脏的途径多样。这些问题有待于进一步研究解决。目前一些新技术已开始应用于实践，如干细胞技术、mRNA沉默策略等。随着人类基因组计划的完成及对基因组功能的逐步阐明，发展新的基因干涉技术的基础现在已经基本建立起来。必将推动基因技术进一步在肾癌治疗领域的发展，不久的将来就会进入临床应用的新阶段。
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（收稿日期:2004-09-20）
（编辑一 凡）
作者单位:100730中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院泌尿外科