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肠黏膜上皮是哺乳动物机体代谢最为活跃的场所，肠上皮细胞终生进行着不间断的自我更新，这是因为位于肠道隐窝内的干细胞保持着旺盛的增殖分化能力。成体细胞的凋亡脱落及受损坏死与干细胞增殖、分化之间保持着动态平衡，由此可见肠上皮干细胞在维持肠道屏障结构和功能的完整以及损伤后的修复中扮演着重要角色。因此了解肠上皮干细胞的相关生物学特性，对临床工作将有重要的意义。同时，肠道是机体营养物质吸收的主要场所，了解肠上皮干细胞群的构建方法，对某些因代谢原因引起的疾病治疗方法的探索上，也具有十分重要的意义。
1 肠上皮干细胞生物学研究进展
小肠与结肠的内壁是一单层柱状上皮，这层上皮由于细胞从有增殖能力的隐窝前移过来而不断被更新。小肠细胞离开隐窝转移到突出于肠腔的绒毛表面。只有位于隐窝出口的绒毛上皮才能成为完全成熟的，具有与分化相关的生化标志的细胞。这些细胞主要为上皮柱状细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞。下面就肠上皮干细胞的有关生物学特性做一个综述。
1.1 微环境 干细胞在获得分化特征之前，先要离开隐窝底部 ［1，2］ 。这说明肠上皮干细胞群的维持需要一个独一无二的微环境。研究表明，微环境对干细胞的调节包括干细胞本身、细胞外基质以及成纤维细胞和成肌细胞等对干细胞的调节。
虽然目前对肠上皮干细胞在小肠隐窝中的具体位置还存在不少争议，但是仍然有不少观念认为隐窝中的潘氏细胞就是事实上的干细胞。潘氏细胞是一种能长期生存的细胞，因而在隐窝底部保持了一种稳定的环境。它们能产生大量的因子用以调节邻近细胞的增殖和分化。这些因子包括表皮生长因子、肿瘤坏死因子α和其他调节细菌数量的因子。
大量证据表明，细胞外基质（ECM）的成分以及它们之间的相互作用对维持肠上皮的功能是非常重要的。首先，这些成分通过调节干细胞对ECM的黏附，从而使隐窝底部干细胞数目的保持或削减达到最佳状态。其次，ECM对肠上皮干细胞增殖和分化的调节也很重要，在发育过程中对小肠上皮干细胞起到正、负两方面生长调节作用。例如，HLx是一种可在多处出现的小鼠同源异性盒基因，在中、后肠的间充质中表达。这种基因对于肠道延伸是必需的，是生长的正向调节因子 ［3］ 。相反，Fkh6缺乏的小鼠表现出肠过度生长，并且在发育和成体阶段均有增殖的严重失调，这说明它是肠上皮生长的负向调节因子 ［4］ 。同时，通过免疫组化的方法观察肠道中的ECM的成分分布，发现紧贴着上皮的基底膜成分如层粘连蛋白（LN）等起着相当重要的调节作用。层粘连蛋白有两种类型，即LN1和LN2。在人体内，这两种蛋白分别独立作用的同时还表现出一种互补的关系。LN1与启动肠的分化有关 ［5］ ，而LN2作用尚不明朗，可能与调节干细胞群体相关。
上皮下成纤维细胞和成肌细胞对于决定干细胞的微环境也起着重要的作用。克隆亚系经分离后的研究表明，不同的成纤维细胞系在诱导胎鼠肠内胚层表型的改变上，具有能力上的差异。有的细胞系能刺激干细胞增殖并使未分化的腺管结构的发育，而有的细胞系可诱导分化标志物并支持正常隐窝/绒毛结构的发育 ［6］ 。成肌细胞在表型上也具有相似的遗传性差异，这些差异有利于维持一个适合肠上皮干细胞生长的环境。
1.2 细胞因子的作用 众所周知，细胞因子在干细胞增殖分化中扮演了重要的调控角色。目前，研究得比较透彻的有表皮生长因子（EGF）以及成纤维生长因子（FGF）等。成纤维细胞生长因子可以促进各种上皮细胞的有丝分裂，并调节细胞的分化，其中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作用于小肠隐窝细胞外基质，通过与干细胞表面的酪氨酸蛋白激酶受体的结合而发挥生物学作用，增强受损的肠道上皮细胞及血管内皮细胞的抗凋亡能力 ［7］ 。小肠上皮遭到放射性辐射损伤后，bFGF及其下游信号分子基因表达升高，可以促进隐窝干细胞的存活 ［8］ 。干细胞因子（SCF）和FGF-2同样可以保护干细胞免受离子辐射的影响 ［7］ 。表皮生长因子（EGF）及其家族成员在消化道黏膜上皮细胞中有分布，并且表达量很高，给予足量的外源性EGF能够加快干细胞增殖分化速度，激活干细胞使之进入快增殖周期，其修复受损肠道上皮的效果较为肯定 ［9］ 。在哺乳动物体内，转化生长因子-β（TGF-β）家族主要的3种成员，即TGF-β1、β2和β3，是上皮增殖的负性调节因子，它们都可以通过调控细胞周期，使干细胞停滞于G 1 期，从而抑制隐窝干细胞的增殖分化。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）也可以有效地促进受损后的小肠上皮干细胞分裂，增加定向祖细胞的数量;而TGF-β作用则相反，它能明显抑制隐窝干细胞的增殖 ［10］ 。胰岛素样生长因子-Ⅰ的作用与EGF相似，但需要与其他生长因子共同协同才能促进干细胞增殖和分化的功能。角化细胞生长因子具有促进并诱导隐窝干细胞分裂，刺激干细胞DNA的合成，提高肠上皮干细胞的数量等功能 ［11］ 。肝细胞生长因子（HGF）对肠上皮干细胞的促增殖作用非常肯定，作为一种促有丝分裂原，HGF可与酪氨酸蛋白激酶受体特异性的结合，而产生一系列相关生物学作用，促进干细胞的增殖。有实验表明在小肠缺血性损伤中，HGF的表达快速升高 ［12］ ，同时，体外培养实验也显示HGF对小肠干细胞具有明显的促增殖作用 ［13］ 。其他生长因子如白介素等对肠道干细胞增殖分化的调控作用近年来也有一定研究，但相关机制还需进一步探讨。
1.3 凋亡机制 在稳定状态下，小肠干细胞也会出现凋亡的现象。凋亡行为能在干细胞分裂之后除掉多余的干细胞 ［14］ ，凋亡是小肠上皮干细胞的一种自身稳定机制（结肠中的自发凋亡并不牵涉干细胞区，这可能是因为结肠中的凋亡与Bcl-2表达有关）。实验证明，在进行小肠切除术后（SBR），增殖和凋亡作为适应反应的一部分都得到了相同程度的增强 ［15］ 。
目前，在基因水平上对肠干细胞凋亡行为的研究已经开展起来了，研究比较多的有p53和Bcl-2等基因。p53和Bax缺陷小鼠在自发凋亡水平方面没有差异（p53缺陷对SBR处理后的凋亡也没有影响） ［15］ 。有实验表明，经过γ辐射后，干细胞区域出现了p53依赖性的凋亡水平升高。这说明，在生理情况下，p53表达极其微弱，而且功能也受到抑制;但在出现病理改变的情况下，p53表达显著增强，可以同时促进小肠上皮干细胞的增殖和凋亡 ［16］ 。最新的研究结果表明，Bcl-2缺陷小鼠在结肠上皮表现出自发凋亡的增加，但是在小肠中没有出现类似的变化;同时，小肠中Bcl-2过表达也不会对自发凋亡造成影响 ［17］ 。这说明，Bcl-2关系到正常结肠干细胞的自我稳定，但对小肠不起作用。同时，在结肠中，经辐射的Bcl-2缺陷小鼠的凋亡水平要高于野生型。可以认为，结肠中的Bcl-2引起了自发消灭多余细胞的自身稳定机制的缺陷，这可以解释为什么结肠上皮相对于小肠而言，对于肿瘤的诱导有更高的敏感性。
2 肠上皮干细胞分离培养方法进展
目前，肠道干细胞生物学研究仍存在一个缺憾，即还没有一种得到公认的、能用于分离和培养肠道干细胞的细胞学特异性标志物。而且，没有真正完善的组织培养方法能够利用肠上皮组织的原代培养去探究集落形成潜能、多能性等肠上皮干细胞的性质。限于目前的研究水平，只能从肠上皮干细胞的集聚体（如胎鼠或新生小鼠的肠道组织），而非完全分离的干细胞建立原代培养，即构建肠上皮干细胞群 ［14］ 。移植实验证明，这样的干细胞群能重新组成正常的上皮 ［18］ 。下面就将有关肠上皮干细胞群构建过程中的一些分离培养方法的相关进展作一个综述。
2.1 材料来源 以取自刚出生、未进奶的新生乳鼠为最好。此时肠腔内无微生物、消除了肠黏膜上皮细胞消化分离过程中微生物感染的来源。而对已进食的新生乳鼠，培养过程中使用的原代培养液、细胞洗涤液、组织分散液中均应加入2倍的抗生素。
2.2 消化酶的选择 分离肠隐窝细胞团是肠黏膜上皮干细胞群体外培养成功的一个关键因素。选择适合的消化酶和适宜的消化时间至关重要，常用的酶有胶原酶、透明质酸酶、中型蛋白酶和胰蛋白酶。一般来说，消化酶对细胞都或多或少的有一些损伤。其中，透明质酸酶对上皮细胞损害最小，但是价格昂贵不易获得;胰蛋白酶又对细胞有很大的毒性。较为经济和理想的消化酶是胶原酶与中型蛋白酶的联合使用，既可以降低酶消化作用的浓度，减轻对细胞的毒性损害，又可缩短消化作用的时间，且肠隐窝细胞团产率较高。此外，酶消化过程中的反复吹打也可促进肠隐窝器官样细胞团从组织中分离释放出来。
2.3 生长基质 肠黏膜上皮干细胞的体外培养对培养支持物表面形状的要求较高。用胶原蛋白包被可有效的改善支持物的形状，促进细胞生长。而未涂胶原蛋白膜的支持物则细胞生长不良。此外，也可采用塑料培养瓶、板或将含高浓度血清（20%）的培养液留置玻璃培养瓶、板中1～2d，血清中的一些蛋白质和纤维素等物质也有促进细胞贴壁的作用。
2.4 血清的浓度和质量 血清质量也是影响上皮细胞贴壁、伸展和生长的重要因素。一般而言，使用低浓度的胎牛血清对肠上皮细胞的生长最为适宜。高浓度的胎牛血清（10%～20%）常常使诸如平滑肌细胞和成纤维细胞等其他细胞增生繁殖。因此，肠上皮干细胞群的体外培养所用的胎牛血清浓度一般不超过5%。
2.5 种植密度 肠隐窝上皮细胞团种植于培养板或瓶中的密度过高，并不利于细胞的贴壁生长，一般每瓶不超过1×10 4 个为宜 ［19］ 。
综上所述，肠上皮干细胞的研究目前虽然还有不少不尽人意之处，但就其前景和运用范围而言，还是令人十分兴奋的。完全可以相信，随着研究的深入，会对肠损伤和其他一些古老的代谢性疾病产生一些新的认识 ［20］ 。
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（编辑子 善）
作者单位:430030湖北武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科