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研制新型的，特别是具有生物活性的人工关节已成为医学工作者面临的重大课题。若能研制出一种与自体骨形态、结构类似的材料及时重建或修复缺损的骨与关节，并能与受体结合，最终存活而成为患者“自身”的材料，这不仅是生物材料学的发展，也必将带来巨大的社会和经济效益。“载体+骨诱导因子（BMP）+生长因子”模式的人工骨已被证实为理想的人工骨生物学材料。笔者设想采用钙磷骨水泥与BMP、TNF-α进行复合，在已钻孔的复合脱蛋白骨关节材料表面涂层及髓腔内填塞，以达到钙磷骨水泥与脱蛋白骨关节移植材料“自锁”。移植后，利用其生物降解特性达到局部持续、高浓度的BMP和TNF-α释放，促进骨愈合。另外，由于钙磷骨水泥无免疫原性，在脱蛋白骨关节表面涂层及髓腔内填充后，是否还可起到早期免疫“封闭”作用，而降低异体脱蛋白骨关节的免疫反应。
1 材料与方法
1.1 材料的制备 （1）兔股骨下端脱蛋白骨（DPB）:将新西兰大白兔处死后取双侧股骨下段（保留关节端，长度15mm），经蒸馏水反复冲洗，用20%过氧化氢等反复脱蛋白，乙醚循环脱脂，制成脱蛋白骨关节材料，低温冷冻保存。（2）人重组肿瘤坏死因子（rhTNF-α）:第四军医大学生物化学所提供。（3）人重组骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）:杭州华东医药集团基因技术研究所提供。（4）钙磷骨水泥（CPC）:上海瑞邦生物材料有限公司提供。（5）DPB/rhBMP-2/rhTNF-α的制备:将rhBMP-2/和rhTNF-α粉末按一定比例与重蒸水混合后，在脱蛋白股骨下段髁间钻孔处及近段截骨处四周进行滴注，并置入冷冻干燥机，真空下冷冻干燥后，环氧乙烷消毒。（6）CPC/rhBMP-2/rhTNF-α的制备:将rhBMP-2和rhTNF-α粉末按一定比例与CPC固定液混合后，再与CPC粉末进行调和，在未固化前将CPC添入复合脱蛋白股骨下段髓腔内，并在其表面均匀涂层。
1.2 动物模型 选取健康成年新西兰大白兔60只（年龄1～1.5岁），雌雄不拘，体重3.0±0.5kg，随机分成A（复合有钙磷骨水泥的异体复合脱蛋白骨关节移植）、B（异体复合脱蛋白骨关节移植）、C（单纯异体脱蛋白骨关节移植）3组。麻醉，暴露股骨远端和胫骨近端，用线锯于距关节面15mm处，锯断股骨，采用张力带钢丝加克氏针固定方法将脱蛋白骨关节固定于断端。复位膝关节，修复关节附属韧带，缝合切口，分笼饲养。
1.3 检测内容 （1）肉眼观察:分别于术后4、8、12、16周处死实验动物，观察骨折愈合情况、局部粘连程度及有无感染、内固定物松动发生，同时在第4周采用游标卡尺测量DBP表面纤维组织包裹厚度。（2）X线照片:各组分别于术后4、8、12、16周于麻醉后行膝关节正侧位摄片。（3）组织学检查:标本截自骨断端和股骨外侧髁关节面，常规切片、HE染色，光学显微镜下观察。（4）透射电镜检查:将标本于3%戊二醛中固定3～4h后，置入0.1%PBS（磷酸缓冲液）中保存，然后EDTA（乙二胺四乙酸）脱钙，锇酸再固定，逐级脱水后环氧树脂包埋，切片，枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色后，H-600型透射电镜观察。
2 结果
2.1 大体观察 A、B组:于术后4周时，见脱蛋白骨表面被薄层纤维组织包裹（见表1），骨断端间有纤维组织连接。第8、12周时，骨断端附近逐渐有骨痂形成。至第16周时，骨断端间被大量环形骨痂包绕，脱蛋白骨与受体骨组织紧密粘着，界限模糊，剥离时可见有散在出血点。膝关节腔内有少量纤维组织粘连，脱蛋白骨关节面仍保持光滑。A组无感染、内固定松动发生。B组有3例发生移植部位化脓性感染（占15%），并导致内固定松动2例。
C组:术后4周时，见脱蛋白骨表面被纤维组织包裹。第8、12周时观察到的骨断端间骨痂在形成速度和量上都明显少于A、B组。至第16周时，脱蛋白骨与受体骨组织间的界限仍然清楚，其膝关节腔内情况与A、B组类似。本组有2例发生局部化脓性感染（占10%），其中1例死亡。
表1 第4周时各组纤维组织包裹厚度 （略）
注:1A、B组两样本间差异有非常显著性（P<0.01）;A、C组两样本间差异有非常显著性（P<0.01）;B、C组间差异无显著性（P>0.05）;2采用多样本两两比较秩和检验（Nemenyi法）
2.2 X线照片 各组术后X线片均显示骨断端对位对线良好。
A、B组:术后第4周时，见骨折线清晰，脱蛋白骨密度较正常骨组织稍高。第8、12周后，骨折线趋于模糊，断端间有骨痂形成。第16周时见骨折线消失，断端间大量环形骨痂形成，骨愈合。脱蛋白骨密度已接近正常骨组织。C组:术后第4、8、12、16周的X线片显示，与A、B组相比其在骨折愈合时间、骨痂形成量上均落后于前两者。第16周时，其脱蛋白骨密度与前并无明显变化。
2.3 组织学检查 A、B组在组织学改变上类似:术后第4周时，脱蛋白骨可见大量新生血管、间充质细胞及散在成骨细胞出现，软骨细胞成熟伴网织状骨形成（见图1、2）。第8周时，大片网织状骨及软骨细胞团形成，并向板层状骨组织转化，但未见有骨爬行替代现象。第12周时，断端间形成大量板层状骨，并有骨髓腔形成，骨髓细胞分化成熟。在脱蛋白骨内可见骨爬行替代现象。邻近关节端处有大量软骨细胞团。第16周时，形成更多板层状骨组织，脱蛋白骨-受体骨界面间并无明显分界线，骨折完全愈合（见图3、4），同时在靠近关节面附近可见较多增生成熟的软骨细胞团（见图5、6）。关节端表面仍保持光滑，但关节面下方并未见明显成骨及成骨软骨活动。A组脱蛋白骨材料内填充的骨水泥在第16周时，可见结缔组织长入，并将骨水泥分割成团、降解，可见成骨细胞活动（见图7）。
C组:术后第4周时，脱蛋白骨内可见少量炎性细胞浸润，血管、间充质细胞及成骨细胞数量较A、B组为少（见图8）。第8周时，部分网织状骨形成，软骨细胞团少。第12周时，板层状骨形成缓慢，亦未见脱蛋白骨替代。关节端仍无软骨细胞团形成。第16周时，断端间有较多板层状骨形成，但脱蛋白骨材料无或仅小范围内骨替代活动，部分动物出现骨折不愈合。关节端软骨细胞团形成少（见图9）。
2.4 电镜检查 A、B组基本为成熟的骨细胞:位于骨陷窝中，胞体呈扁卵圆形，有许多细长的突起，体积较小，胞质浓聚，细胞器少，核呈卵圆形。C组大部分成骨细胞:细胞丰满，呈卵圆形，核内有核仁，以常染色质为主，少量异染色质积聚于核边缘，胞质内有大量粗面内质网、发达的高尔基体及基质小泡。
3 讨论
3.1 异体复合脱蛋白骨关节移植的成骨与成软骨作用 近10年来，我院骨科实验室自行成功研制出脱蛋白骨，其形态近似受体骨，免疫源性低，具有良好的生物力学性能等优点。同时在实验及临床应用中发现，虽经脱脂、脱蛋白等一系列生物化学处理，关节软骨已被破坏，但其关节骨端仍非常光滑。经组织学检查，该层主要为胶原纤维。受此启发，而萌发将脱蛋白异体骨关节用于实验及临床的设想。但是脱蛋白骨不具有骨诱导活性，而仅有骨传导作用，动物实验及临床应用表明 ［1］ ，行脱蛋白关节骨端移植后，不仅能与宿主骨愈合，其关节端也有关节软骨生长，但骨愈合时间较长（4～8个月），部分病例仍有免疫反应是其主要缺点。为此，笔者引入了“载体+骨诱导因子（BMP）+生长因子”人工骨生物学材料模式。BMP（Bone Morphogenetic Proteins，骨形态发生蛋白）是一种高效的骨诱导物质 ［2］ ，能诱导血管周围的未分化间充质细胞和骨髓基质细胞分化成为软骨细胞和骨细胞。根据笔者以往的研究发现 ［3～5］ ，采用脱蛋白骨（DPB）/BMP/TNF-α复合人工骨表现出良好的成骨能力，因此本实验沿用了该模式，并与单纯脱蛋白骨关节移植作比较。
笔者的实验采用股骨下段关节端移植模型基于以下几点考虑:（1）兔膝关节的解剖结构相对简单，易于手术操作;（2）便于采取内固定和外固定;（3）对实验动物的正常生理活动影响较小;（4）术后脱位率发生较低。
本研究中，实验组（A、B组）均采用了DPB/rhBMP/rhT-NF-α复合人工骨关节，结果表明DPB/rhBMP/rhTNF-α确能提高成骨能力和促进脱蛋白骨材料的爬行替代，加速骨断端的愈合，这一点与过去的研究相符 ［4，5］。其机制考虑有以下几点因素:（1）BMP作为一种高效的骨诱导物质它能诱导血管周围的未分化间充质细胞和骨髓基质细胞分化为 成软骨细胞和成骨细胞。在本实验中，其骨诱导作用主要是通过软骨内成骨的方式进行，这一结果与许多复合BMP的植入材料的诱导活性一致 ［6，7］ ;（2）rhTNF-α能促进移植区毛细血管的生成 ［8］ :①提供了良好的骨愈合基础;②可带来更多的间充质细胞，从而为BMP的骨诱导提供更多的靶细胞;③带来更多的巨噬细胞，产生更多的生长因子。（3）一定条件下TNF-α本身可能具有一定成骨能力 ［4，9，10］ 。由于单纯脱蛋白骨关节组缺少BMP和TNF-α的作用，因此其成骨能力不如复合脱蛋白骨关节组。异体复合脱蛋白骨关节良好的成骨能力为我们提出了今后将其应用于骨与关节缺损治疗的可能性。此外脱蛋白骨关节四周均为坚韧的皮质骨，这保证了其具有一定的生物力学强度，有利于在负重部位的重建。
各组至第16周时，在脱蛋白骨关节远端关节面下方并未见明显成骨及成软骨活动，只有A、B组在邻近关节端、骨干与关节面交界处出现较多增生成熟的软骨细胞团，显示出在关节面成软骨作用的缺乏。可能原因为:关节面位于脱蛋白骨关节最远端，离受体血供区也最远;该处缺乏相应的BMP和TNF-α作用的靶细胞;观察时间不足。同时笔者也发现，虽然在脱蛋白骨关节面处并未见明显的成软骨作用和软骨替代，但关节面始终保持光滑，从而对关节功能不至于造成太大的影响。脱蛋白骨关节端最终的转归以及如何促进关节面软骨的修复还有待于以后的研究观察。
3.2 复合钙磷骨水泥对异体复合脱蛋白骨关节成骨能力和免疫反应的影响 笔者采用钙磷骨水泥作为BMP和TNF-α的载体，在复合脱蛋白骨关节表面涂层，以及填入其髓腔内，其构想在于，将BMP和TNF-α复合钙磷骨水泥后，移植时，利用钙磷骨水泥良好的生物降解性以达到局部持续、高浓度的BMP和TNF-α释放。由于钙磷骨水泥无免疫源性 ［11，12］ ，在复合脱蛋白骨关节表面涂层及髓腔内填充后，还可起到早期免疫“封闭”作用，以期降低异体脱蛋白骨关节的免疫反应。研究结果显示，在植入复合人工骨关节的第4周，A组脱蛋白骨关节纤维包裹厚度要低于B和C组（P<0.01），而B、C组间差异无显著性（P>0.05）。此外，A组实验动物无一例发生术后感染，而B、C组术后感染率分别达到了15%和10%。以上结果表明在A组中发生的炎症反应要轻于B、C组，从侧面反映了在复合脱蛋白骨关节表面涂层及髓腔内填充钙磷骨水泥后，能降低异体脱蛋白骨关节的免疫反应。需要指出的是，由于钙磷骨水泥在体内降解速度较快（在第4周时观察到在脱蛋白骨表面的钙磷骨水泥已被降解消失），因此这种免疫“封闭”作用限于早期。而正是这种早期免疫“封闭”作用避免了手术创伤炎症反应和免疫反应高峰期的重合，降低了术后感染率的发生。但是，组织学检查表明，光镜下各时期的成骨面积A、B组间差异无显著性，提示采用复合钙磷骨水泥对异体复合脱蛋白骨关节的成骨能力并无明显影响。笔者认为有以下几个方面原因:（1）绝大部分复合钙磷骨水泥填入了脱蛋白骨关节髓腔内，被坚韧的骨皮质所包绕，限制了其生物降解和释放BMP和TNF-α;（2）在进行脱蛋白骨关节置换术时，需广泛剥离骨膜，在很大程度上减少了BMP和TNF-α作用的靶细胞，此时局部生物因子浓度在量上小的差异并不会造成成骨能力明显的不同。（3）实验中笔者采用的CPC与BMP及TNF-α的复合比例是否是最适宜的比例还需要进一步摸索。（本文图见封3）
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（编辑江 风）
* 基金项目:重庆市科委资助项目
作者单位:646000四川泸州医学院附属医院骨科
400016重庆医科大学第一附属医院骨科