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【摘要】 目的 探讨S-期激酶相关蛋白（Skp2）表达与胃癌临床病理学特征间的关系。 方法 利用半定量RT-PCR和免疫组化Envision方法检测Skp2mRNA和蛋白在胃癌及正常组织中的表达。 结果 50例胃癌组织中Skp2mRNA的表达量明显高于正常组织（ω=688，P<0.01）。pT 3～4 胃癌组织中COX-2mRNA的表达明显高于pT 1～2 胃癌组织（ω=352，P<0.01）。60份胃癌石蜡标本中有42份Skp2阳性表达，阳性率为70.0%。Skp2阳性表达与浸润深度、淋巴结转移、UICC分期显著相关（P<0.01），与组织学类型、脉管侵犯无关。 结论 Skp2在胃癌的发生发展过程中起着重要作用，其高表达提示患者预后不良。
关键词 胃癌 S-期激酶相关蛋白 基因
Expression and clinical significance of S-phase kinase-associated protein2in gastric cancer
Wang Xingping，Yu Jiren，Chen Guosheng，et al.
Department of Surgery，Yuqian Peoples Hospital of Linan，Zhejiang311311.
【Abstract】 Objective To study the relationship between expression of S-phase kinase-associated protein2（Spk2）and the clinicopathological feature in gastric cancer.Methods The Spk2mRNA and protein were examined in gastric cancer tissue and normal tissue by semi-quantitative RT-PCR and immunohistochemistry.Results The expression of Spk2mRNA in gastric cancer tissue was significantly higher than that of nomal tissue in50cases（ω=688，P<0.01）.The Spk2mRNA in pT 3～4 tissue expressed much higher than that of pT 1～2 （ω=352，P<0.01）.The postive rate of Spk2was70.0%（42/60）.It was found that the expression of Spk2was significantly related to in-vasion depth，lymphatic metastasis and UICC TNM stage in gastric cancer（P<0.01）.No relationship was found be-tween Spk2expression and histological type and vascular invasion.Conclusion Spk2may play an important role in the development of gastric cancer，and the expression of Spk2protein might have a poor prognosis.
Key words gastric cancer S-phase kinase-associated protein2 gene
S-期激酶相关蛋白（S-phase kinase-associated protein2，Skp2），作为F盒（F-box）蛋白家族中的一员，在G 1 -S细胞周期中起重要调控作用，其已被证明与细胞转化和肿瘤形成有关 ［1］ 。本研究通过对Skp2在基因和蛋白水平的检测，分析其与临床病理学特征间的关系，探讨Skp2在胃癌发生发展过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本
1.1.1 RT-PCR标本 我院2001年11月～2003年5月经手术切除病理证实的50例患者的胃癌组织和正常胃黏膜组织。50例患者中男27例，女23例，平均年龄（56.5±13.5）岁。标本液氮速冻后转移至-80℃保存。
1.1.2 免疫组化标本 我院1996年1月～2000年12月经手术切除病理证实的60例患者的胃癌标本。60例患者中男48例，女12例，平均年龄（52.6±15.4）岁。标本经福尔马林固定，石蜡包埋，4μm切片。10例正常胃黏膜组织作为阴性对照。
1.2 RT-PCR检查
1.2.1 总RNA提取 取50mg组织，参照TRIzol（Gibco公司）试剂提取说明书提取总RNA，溶解于无RNA酶的DEPC H 2 O中，经微量紫外分光光度计定量后-80℃保存。
1.2.2 引物序列 采用Primer Design3.0软件设计并参照相关文献 ［2］ ，由上海生物工程有限公司合成。β-actin上游引物序列为:5'-TCGTGATGGACTCCGGTGAC-3'，下游引物序列为:5'-TCGTGGATGCCACAGGACTC-3'。目的条带为330bp。Skp2上游引物序列为:5'-GCTGCTAAAG-GTCTCTGGTGT-3'，下游引物序列为:5'-AGGCTTA-GATTCTGCAACTTG-3'。目的条带为245bp。
1.2.3 RT-PCR 取3μl总RNA，参照Promega公司M-MLV逆转录试剂说明书用六聚随机引物合成cDNA，在25μl反应体系进行扩增。PCR反应条件为:95℃预变性4min，然后循环的扩增，最后72℃延伸10min。每个循环包括94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共26个循环。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统（Kodak digital science system DC120）读取目的条带OD值，取其与β-actin条带的OD值的比值作为Skp2的相对表达量。
1.3 免疫组化 采用Envison两步法，4μm石蜡切片脱蜡至水后，3%过氧化氢甲醛溶液阻断内源性过氧化物酶活性。高压加热修复抗原3min后，依次加入Skp2鼠抗人单克隆抗体（1∶200，Zymed公司），HRP标记的羊抗鼠IgG（En-vision二抗，DAKO公司）。二氨基联苯氨（DAB）显色。细胞核内有棕色颗粒堆积的为阳性细胞，切片内阳性细胞数≥30%为组织表达阳性 ［4］ 。
1.4 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件，采用Wilcoxon检验、χ 2 检验进行统计学处理，P<0.05判定为有统计学差异。
2 结果
2.1 Skp2mRNA在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达 经RT-PCR扩增后的Skp2为245bp，内对照β-actin为330bp，如图1所示。50例胃癌组织中均有不同密度的Skp2条带出现，其表达量为1.08±0.65，正常胃黏膜表达量为0.33±0.21，两者差异存在显著性（ω=688，P<0.01）。pT 1～2 胃癌组织的表达量为0.85±0.43，pT 3～4 为1.14±0.67，两者差异有非常显著性（ω=352，P<0.01）。
2.2 Skp2蛋白表达及胃癌临床病理学特征间的关系 阳性切片显示Skp2蛋白表达位于细胞核内，如图2所示。60例标本中有42例表达阳性，阳性率为70.0%。10例正常胃黏膜组织均为阴性表达。经统计分析，Skp2阳性表达与浸润深度、淋巴结转移、UICC分期显著相关（P<0.05），与组织学类型、脉管侵犯无关（P>0.05）。如表1所示。
表1 Skp2蛋白表达与胃癌临床病理学特征间的关系 （略）
3 讨论
Skp2作为细胞周期调节蛋白F盒蛋白家族成员，在细胞周期G 1 ～S期转化过程中起着正向调控作用，其对于正常或异常细胞进入S期是必需的。在体外和体内研究中发现Skp2的过度表达可以通过促进泛蛋白连接酶（SCF复合体）对细胞周期素依赖性激酶抑制因子p27的降解，促使细胞转化以及肿瘤细胞的增殖 ［3］ 。在前列腺癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌等恶性肿瘤中均能观察到Skp2的过度表达，Skp2在肿瘤的进展中扮演十分重要的角色，并且可能是肿瘤治疗的关键靶点之一 ［4，5］ 。Signoretti S等 ［6］ 研究发现，Skp2在人乳腺癌中的表达水平与肿瘤的恶性程度显著相关，肿瘤恶性程度越高，侵袭性越强，Skp2表达水平越高。本研究结果显示，Skp2mRNA在正常胃黏膜组织中有少量表达，可能是执行正常细胞生物学功能所需。在胃癌组织中Skp2mRNA表达量异常增高，并随着肿瘤浸润深度加重其表达量增加，其中pT 3～4 胃癌组织中表达量明显高于pT 1～2 。提示Skp2表达量的多少与肿瘤细胞侵袭性的强弱密切相关，这与文献结果相一致 ［2］ 。本研究免疫组化的结果显示，伴有淋巴结转移的胃癌组织中Skp2蛋白表达阳性率为86.8%，明显高于淋巴结阴性转移组（40.9%）:pT 3～4 胃癌组织中Skp2蛋白表达阳性率为87.5%，较pT 1～2 组（50.0%）显著增高。Ⅲ～Ⅳ期组的Skp2蛋白表达阳性率为88.2%，与Ⅰ～Ⅱ期组（46.1%）差异有显著性。上述结果同样提示Skp2阳性表达的肿瘤更易发生转移和深部浸润生长，此结果与Masuda ［2］ 报道相似。本研究中未显示Skp2与肿瘤脉管侵犯和组织学类型间的关系，可能与样本的选择和数量有关，需进一步研究探讨。综上所述，Skp2在胃癌的进展过程中起着重要的作用，深入对其的研究，将可能为胃癌的治疗和预后带来新的启示。（本文图片见封三）
参考文献
1 Carrana AC，Eylan E，Hershko A，et al.Skp2is required for ubiquitin-mediated degradation of the CDK inhibitor p27.Nat Cell Biol，1999，1:193-199.
2 Masuda TA，Inoue H，Sonoda H，et al.Clinical and biological sigmfi-cance of S-phase kinase-associated protein2（Skp2）gene expression in gastric carcinoma:modulation of malignant phenotype by Skp2over-pression，possibly via p27proteolysis.Cancer Res，2002，62:3819-3825.
3 Sutterluty H，Chatelain E，Marti A，et al.p45Skp2promotes p27Kipl degradation and induces S phase in quiescent cells.Nat.Cell Biol，1999，1:207-214.
4 Slingerland J，Pagano M.Regulation of the cdk inhibitor p27and its deregulation in cancer.J Cell Physil，2000，183:10-17.
5 Porter PL，Malone KE，Heagerty PJ，et al.Expression of cell-cycle regulators p27kipl and cyclin E，alone and in combination，correlate with survival in young breast cancer patients.NatMed，1997，3:222-225.
6 Signoretti S，Di Marcotullio L，Richardson A，et al.Oncogenic role of the ubiquitin ligase subunit Skp2in human breast cancer.J Clin Invest，2002，110:633-641.
（编辑子 善）
作者单位:311311浙江省临安市於潜人民医院外科
310006浙江大学医学院附属一院外科