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【摘要】 目的 通过对MHCC97肝癌细胞株的FAK基因的表达进行干预，观察MHCC97肝癌细胞侵袭转移能力的变化。 方法 用Oligofec TAMINE介导的方法，将反义FAK ODN引入MHCC97肝癌细胞株，或用Genistein抑制MHCC97肝癌细胞FAK磷酸化方法，观察经过不同干预后的MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的活力变化，比较MHCC97肝癌细胞转染反义FAK ODN前后和用Genistein抑制磷酸化前后，细胞侵袭转移能力的变化。 结果 反义FAK ODN转染的肝癌细胞和用Genistein干预的肝癌细胞穿过Matrigel胶的能力减弱。 结论 抑制FAK的表达能影响肝癌细胞的侵袭转移能力。
【关键词】 FAK;肝癌细胞;侵袭
Inhibitory effects of FAK on the invasion of MHCC97hepatocellular carcinoma cells
ZHU Chen-fang，GUYan，WANG Bing.
Department of Surgery，Ninth People's Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai200011，China
【Abstract】 Objective To study the inhibitory effects of antisense focal adhesion kinase（FAK）oligodeoxynucle-otides（ODN）and Genistein on the invasion of MHCC97hepatocellular carcinoma cells.Methods Oligofec TAMINE-mediated antisense FAK ODN was transfected and Genistein was added into MHCC97hepatocellular carcinoma cells.The invasive activity of tumor cells was assayed in a transwell cell culture chamber has been dealed withMatrigel first.Compare the changes between them.Results Antisense FAK ODN and Genistein can both decrease the invasion of MHCC97hepatocellular carcinoma cells.Conclusion Inhibition of FAK expression can inhibit the invasion ability of MHCC97hepatocellular carcinoma cells.
【Key words】 FAK;hepatocellular carcinoma cell;invasion
肝癌严重威胁着人类的健康，在中国肝癌的发病率一直呈逐年上升趋势。我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌年死亡总数的45%。肝癌的侵袭转移性高是其治疗失败的主要原因。尽管目前对肝癌的治疗，无论是在手术还是在局部或全身的辅助治疗（包括放疗、化疗）措施上都取得了很大的进步。但仍难以控制其在局部和远处的转移。因此发展新的治疗策略具有十分重要的意义。从细胞、分子及所组成的网络结构认识细胞信号转导通路异常在肝癌细胞侵袭转移中的作用。为肝癌的防治提供新的思路。
本文中我们通过反义FAK ODN转染和Genistein抑制FAK磷酸化分别对MHCC97肝癌细胞FAK的表达进行不同干预，探讨受干预后的MHCC97肝癌细胞的侵袭力的变化。
1 材料与方法
1.1 实验材料 MHCC97肝癌细胞株由上海医科大学附属中山医院肝癌研究所提供。Oligofec TAMINE TM Reagent购于Invitrogen公司。Transwell小室购于美国Corning Costar公司。Genistein（4、5、5-Trihvdroxyisoflayone FW:270.2）和二甲基亚砜（DMSO）共同购于Sigma公司。Matrigel胶购于BD Biosciences公司。
1.2 Oligofec TAMINE介导的反义FAK ODN转染 反义FAK ODN5'-ATAATCCAGCTTGAACCAAG-3'。由上海生工生物工程公司DNA合成，全硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，冻存。Oligofec TAMINE按产品说明书介导转染培养细胞。对照组只加入脂质体不加入反义FAK ODN。
1.3 Genistein抑制FAK磷酸化 以10μg/ml的终浓度加入细胞培养液中，并使DMSO终浓度为0.4%。实验对照组以同样终浓度为0.4%的溶剂处理。
1.4 细胞体外侵袭能力检测法 Transwell小室是目前常用的Matrigel胶重建基底膜系统，是体外研究肿瘤细胞侵袭和转移行为的简便和快速有效方法。聚碳酸滤膜（8μm孔径）黏附于Transwell小室后，以50μl含5μg纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的PBS处理Transwell小室的聚碳酸滤膜下表面，室温下过夜干燥。
Matrigel用含0.1%小牛血清的培养基稀释成100μg/ml，加入滤膜上表面（5μg/滤膜），室温下通风橱中干燥过夜。用前Matrigel以40μl无血清培养基重建20min后备用。将行不同预处理后的细胞用无血清培养基洗3次，0.25%胰蛋白酶消化，重悬于含0.1%BSA的培养基中，取2×10 6 /ml细胞100μl加入至上室，600μl0.1%小牛血清培养基加入下室。37℃、5%CO 2 条件下培养20h后，滤膜用甲醇固定5min，行Gimsa染色。去除滤膜上层细胞，显微镜下（×320）计数滤膜下表面细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复2次，实验重复2次，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。
1.5 统计学方法 采用t检验。
2 结果
我们发现转染反义FAK ODN和经Genistein处理后的MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的能力下降，提示细胞的侵袭力减弱，见表1。
表1 各组细胞穿透Matrigel胶的穿膜侵袭细胞数目 略
3 讨论
肝癌的侵袭和转移是其主要的致死因素，转移过程是以侵袭为基础发生的，因此侵袭也是转移的先决条件和前提，侵袭过程中肿瘤细胞脱离原发部位与基底膜相互黏附，并分泌降解酶降解BM和ECM。然后移动并穿过ECM，再侵入血液循环。进而形成转移灶 ［1］ 。由此可见肿瘤细胞的黏附及运动在侵袭过程中具有重要的意义。本文着力研究肝癌细胞的侵袭转移。
整合素介导的信号转导过程中的关键性信号分子—FAM（focal adhesion kinase）在肿瘤侵袭转移中的作用正受到重视。FAK基因编码位于8q24，cDNA全长4285，编码1028个氨基酸 ［2］ 。pp125 FAK 是一个分子量为125KD的非受体的非膜性的胞质酪氨酸蛋白激酶，在绝大多数组织和细胞中均有表达。1992年首先由Schaller鉴定。从鸟、鼠、非洲蟾蜍获得的FAK的cDNA中推导的蛋白质顺序发现FAK有高达90%的同源性，表明FAK在进化上高度保守 ［3］ 。研究发现FAK与细胞的黏附、运动等活动的信号转导中起着重要作用 ［4］ 。而且它还调节着多细胞生物的分裂、生长、发育和凋亡等生物学行为 ［5］ 。目前已发现FAK在人类许多不同类型的肿瘤中过度表达，而在良性肿瘤或正常组织中FAK 表达并未显著增高。某些研究还表明对于癌前病变，FAK的过度表达可能是一个向肿瘤转移侵袭演化的一个早期事件的标志。FAK在肿瘤向恶性侵袭表型演进过程中起着重要作用，其与肿瘤侵袭转移的高度相关性已在一些研究中得到证实 ［2］ 。更有其他研究显示，同时有淋巴结转移的癌组织FAK的表达较无转移者高，二者阳性率差异有显著性 ［6，7］ 。肿瘤细胞具有侵袭的特征，能够穿透基底膜形成侵袭转移。细胞的迁移运动能力是肿瘤细胞侵袭转移的重要环节 ［8］ 。本研究涉及的细胞移动实验很好而简便的反映了肿瘤侵袭转移的全过程—降解、黏附、移动。因而细胞穿越Matrigel的能力能够反映细胞的侵袭能力。
本实验结果显示，无论是从基因水平抑制FAK的表达，还是用Genistein抑制FAK磷酸化均可以有效抑制MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理过的Transwell小室的能力。提示抑制FAK的表达可以使MHCC97肝癌细胞穿膜侵袭活力下降。FAK在肿瘤细胞的侵袭行为中起着重要作用。
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作者单位:200011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院普外科
（编辑:建 伟）