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早在1817年，Justinus Kerner首先认识到，食物中所携带的某种毒素，能够导致骨骼肌和副交感神经功能麻痹。至1895年，Van Ermengem在一次暴发性食物中毒流行病学调查，于食物与人体内均检出了革兰阳性、厌氧肉毒梭菌（clostridium botulinum），并定名为“肉毒病（botulism）”。肉毒梭菌所产生的肉毒毒素（botulinum toxin,BTX）具有极强的毒力，低至0.05 μg即可致死［1］。
1 肉毒毒素的结构
肉毒毒素通常可划分为7种类型，即A、B、C、D、E、F、G型肉毒毒素，其中C型又可分为C1和C2（或称Cα和Cβ）两个亚型，因此又有8型提法。各型肉毒毒素的抗原性（antigenicity）和免疫原性（immunogenicity）及其毒性作用机制不同，但分子结构基本一致。无论自然状态还是人工培养，肉毒梭菌所产生的肉毒毒素通常以神经毒素与血凝素或非血凝活性蛋白复合体的形式存在，血凝素等非神经毒素蛋白对维持毒素三维结构及稳定性起着重要作用。此种存在形式即为“前体毒素（progenitortoxin）”。如同多种生物活性蛋白一样，肉毒毒素生物活性与其空间形态结构相关：（1）40 ℃以上，特别是碱性环境，很容易发生肉毒毒素热变性；（2）空气/液体界面形成的气泡，能够引起神经毒素的伸展和形状改变，从而使毒素溶液失去毒性；（3）氮气和二氧化碳环境，也能发生毒素变性；（4）过低浓度稀释（如ng/ml）能够降低神经毒素稳定性，但是采用pH≤6.8的其他蛋白（如明胶、牛或人血清白蛋白）缓冲液稀释则能有效防止这一效应，因此通常的药用肉毒毒素产品即是一种复合制剂［1~3］。各型肉毒毒素神经毒素具有相近的分子量，即为约150kDa单链多肽。无论内源还是外源性蛋白分解酶，均可将此单链多肽切割为双链，双链间至少有一个二硫链联结。打断二硫链彻底分离的两条多肽链中一条分子量100kDa肽链即为重链（heavy chain,H链），H链的羧基端与靶细胞受体具有高度特异性结合位点，H链的氨基端则相关于细胞内呑转运活动；另一条分子量50kDa肽链即为轻链（light chain,L链）L链实质是锌肽链内切酶（Zinic endopeptidase），是毒素的活性成分［1~3］。
2 肉毒毒素的作用
机制神经毒素的作用发挥需经过4个步骤（见图1）：（1）神经毒素H链的羧基端受体识别位点与胆碱能神经末梢质膜上受体特异性结合。（2）在受体介导下，经能量依赖性细胞内呑作用（endocytosis），完成神经毒素跨膜转运，形成胞内体（endosome）。（3）酸性环境的胞内体，神经毒素经一系列蛋白分解活动，形成L链—锌肽链内切酶并释放进入神经细胞胞质。（4）L链—锌肽链内切酶的作用底物不同肉毒毒素类型不同，BTX-A、E、Cl的L链裂解突触相关膜蛋白（SyNaptosomal Associated Protein 25,SNAP25），BTX-C的L链裂解突触融合蛋白（Syntaxin），BTX-B、D、F、G的L链裂解囊泡相关膜蛋白（VAMP/Synaptobrevin）；然而，各型毒素L链作用底物—SNAP25、Syntaxin、VAMP的复合物，又称SNARE（可溶性的NSF［N-乙基-马来酰亚胺-敏感因子］-附着蛋白受体）复合物，则是介导乙酰胆碱囊泡停靠突触前膜及出胞的必需，如此任何类型毒素的最终效应阻止了SNARE复合物形成，从而抑制了乙酰胆碱以囊泡为单位的“倾囊”式突触间隙释放，即所谓量子式释放［1~3］。
3 肉毒毒素作用的临床效应
3.1 肌肉化学性去神经支配效应 肉毒毒素作用的最主要临床效应是乙酰胆碱突触间隙量子式释放抑制，从而阻断了有效性神经-肌接头的兴奋传递，致使肌肉失神经支配，临床则表现为肌肉弛缓性瘫，即所谓的肌肉“化学性去神经支配（chemodenervation）”；这是迄今临床应用肉毒毒素治疗肌肉高张更为普遍认同的理论基础［1~3］。而20世纪末，有 图1 神经毒素作用4个步骤图解（略）学者提出了肌肉反射活动抑制（或牵张反射抑制）理论。1993年Filippi［4］对鼠下颌肌BTX-A注射后进行的肌梭（muscle spindle）功能试验研究，发现Ⅰa类纤维传入功能减退，因此认为肉毒毒素肌肉注射也影响着肌肉感觉传入反馈环路，从而影响着肌张力；1996年Rosales等［5］对鼠股二头肌BTX-A注射后梭外肌（extrafusal muscle）与梭内肌（intrafusal muscle）试验研究指出，在肌肉部分性去神经支配前提下，肉毒毒素可能通过梭内肌阻滞效应致使肌梭紧张性降低，从而继发性减弱了Ⅰa纤维的传入冲动，进而发挥着感觉反馈性肌张力下降效应。显然，无论直接导致梭外肌弛缓性瘫还是梭内肌阻滞后肌梭敏感性下降所致的肌紧张性（张力）减退，均属肌肉化学性去神经支配范畴；而基于梭外肌纤维数量上占绝对优势的肌肉组织学特性，临床又几乎不可能将特异性肉毒毒素注射至肌梭，并且肌紧张性（张力）维持又是众多梭外肌运动单位交替收缩的结果，因此肉毒毒素作用的临床肌肉效应，无论是首先出现的时间还是临床表现程度，都更可能直接展示为肌肉弛缓性瘫，而肌张力改变可能并无明显性临床表现乃至并无实际临床意义。
3.2 植物神经系统效应 生理学研究业已确认，副交感神经节后纤维亦属胆碱能神经纤维。临床采用BTX-A注射这些纤维所支配的唾液腺，有效治疗了脑性瘫痪的多涎病症［6］。其机制实质上类似于“肌肉化学性去神经支配”，即阻断了副交感神经节后纤维与受支配腺体间的兴奋传递［6］。而且，另有肉毒毒素成功应用于多汗症的临床治疗文献报道，这也印证了肉毒毒素对副交感神经胆碱能节后纤维作用的理论。
3.3 镇痛效应 随着BTX-A治疗肌肉痉挛临床应用的不断推广，众多研究发现，患者相应存在的疼痛症状亦得到了显著性缓解，迄今为止，更普遍性认为这是肌肉痉挛解除后的附带效应——即所谓痉挛相关性疼痛解除［3，7，8］。但是近来不少学者发现，疼痛减轻程度一定程度上或有时超出了肌肉松弛程度。经福尔马林足跟部皮下处理建立的鼠炎性疼痛模型研究发现，足跟炎性反应区BTX-A处理后，并无明显的肌肉松弛表现却可见鼠疼痛行为反应显著性下降，而且伴有来自外周初级感觉传入神经的谷氨酸酯（glutamate,Glu）和（或）神经肽（neuropeptides）类物质释放抑制；如此认为，BTX-A抑制了外周疼痛刺激的感受敏感性，继而伴随感觉传入冲动的减低减弱了中枢的感觉敏感性［8］。
4 肉毒毒素作用的转归
4.1 神经-肌接头转归 迄今为止，大量研究确认，BTX发挥肌肉化学性去神经支配的过程中，BTX中毒神经末梢（神经-肌接头），并未发生BTX制导的神经末梢细胞膜（包含突触前膜）、突触间隙、突触后膜等结构破坏，亦即是中毒神经-肌接头的解剖结构完整；只是在神经-肌接头突触前膜侧的神经末梢细胞内，发生了BTX介导、阻碍SNARE复合物形成的诸多膜蛋白分子结构破坏，致使乙酰胆碱囊泡释放抑制。如此的BTX作用机制，普遍认同是临床BTX靶肌注射后，其效应期有限并最终恢复肌肉原本功能状态的基础。通常，临床BTX-A靶肌注射后，12~72 h出现肌肉化学性去神经支配效应——即相关于单肌注射剂量与范围的肌肉松弛乃至弛缓性瘫，此种肌肉效应可保持3~6个月。最终的肌肉原本功能状态恢复，早先认为是中毒神经末梢、临近神经-肌接头的无髓鞘轴突区域侧才可发生芽生并建立新的神经-肌接头的结果；后来认识到，随着BTX的清除、突触前膜和乙酰胆碱囊泡膜上形成SNARE复合物的膜蛋白结构也修复（此修复可能是神经元新合成蛋白的膜结构表达，抑或是酶介导的蛋白分子结构再修复），原本中毒的神经-肌接头将重新恢复兴奋传递功能［1~9］。1999年DePaiva等［9］对鼠肌肉注射BTX-A后神经-肌接头功能修复试验研究后，提出了修复过程的两个阶段观点。第一阶段，BTX-A注射后原始神经-肌接头中毒失去功能，后续数天内肌肉致瘫而诱导内在与外在神经营养因子（neurotrophic factors）和蛋白酶（proteases）水平改变，进而触发了中毒神经末梢胞膜迅速延展的芽生；芽生可能形成幼稚性突触联系，而成为早期肌肉功能恢复电生理迹象的基础。第二阶段，随着BTX-A清除、神经末梢膜蛋白结构修复，原始神经-肌接头功能逐渐恢复；在竞争抑制机制作用下，乙酰胆碱囊泡逐步集中至原始神经末梢，并伴同逐步的新芽结构退化及清除，最终原始神经-肌接头功能完全性恢复。需要指出的是，De Paiva等［9］的结论是建立在单次肌肉BTX-A注射基础之上的，而临床实践中不乏追加、重复BTX注射治疗患者，如此至少在此类患者肌肉功能恢复过程及机制可能远较两阶段理论复杂。但无论基础试验研究还是临床实践研究，一致性结论体现在：（1）BTX临床化学性去神经支配是一限时性效应；（2）芽生的最终结局，无论是否形成成熟性神经-肌接头，其绝大多数幼稚结构终将被清除；（3）原始神经-肌接头确有最终完全性恢复潜力，而在追加、重复性治疗策略下（即累积效应）是否对其有影响尚需研究，但至少在单次肌肉注射中它可能是最终结局。
4.2 化学性去神经支配肌肉预后 BTX肌肉注射后是否会发生肌纤维化或萎缩，1989年Borodic等［10］睑痉挛BTX注射治疗报道，发现存在睑肌纤维化与萎缩表现。但是，近年的众多研究认为，区别于乙醇或酚注射致使外周神经Waller变性而继发肌肉持久性失神经支配所最终产生的肌纤维化与萎缩，BTX注射仅仅产生肌肉短期内失神经支配，至今既无试验研究亦无临床确凿证据表明BTX注射后将发生肌纤维化与萎缩；更有学者肯定性指出，BTX注射治疗并无真正意义上的完全性肌肉失神经支配，而肌肉组织、肌纤维内部结构也不会有任何相应性实质改变［1~7］。但至少在BTX重复注射治疗，如此延长了BTX治疗效应患者是否有肌肉退变可能，至今尚且缺乏完全随机对照类的充分性客观研究结论。
［参考文献］
1 Jankovic J.Botulinum toxin in clinical practice.J Neurol Neurosurg Psychiatry,2004,75:951-957.
2 罗蓉，毛萌.肉毒毒素在脑性瘫痪康复中的应用.实用儿科临床杂志，2005，20（6）：594-596.
3 Singhi P,Ray M.Botulinum toxin in children with cerebral palsy.Indian J Pediatr,2004,71:1087-1091.
4 Filippi GM,Errico P,Santarelli R,et al.Botulinum-A toxin effects on rat jaw muscle spindles.Acta Oto-Laryngol,1993,113:400-404.
5 Rosales RL,Arimura K,Takenaga S,et al.Extrafusal and intrafusal muscle effects in experimental botulinum toxin-A infection.Muscle Nerve,1996,19:488-496.
6 Suskind DL,Tilton A.Clinical study of botulinum-A toxin in the treatment of sialorrhea in children with cerebral palsy.Laryngoscope,2002,112(1):73-81.
7 Barwood S,Baillieu C,Boyd R,et al.Analgesic effects of botulinum toxin A:a randomized,placebo-controlled clinical trial.Dev Med Child Neurol,2000,42(2):116-121.
8 Aoki KR.Review of a proposed mechanism for the antinociceptive action of botulinum toxin type A.Neurotoxicology,2005,26(5):785-793.
9 De Paiva A,Meunier FA,Molgo J,et al.Functional repair of motor endplates after botulinum neurotoxin type A poisoning:biphasic switch of synaptic activity between nerve sprouts and their parent terminals.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(6):3200-3205.
10 Borodic GE,Cozzolino D.Blepharospasm and its treatment,with emphasis on the use of botulinum toxin.Plast Reconstr Surg,1989,83:546-554.
作者单位： 1 835000 新疆伊宁，解放军第11医院
2 830000 新疆乌鲁木齐，解放军第23医院
(编辑：周 蕊)