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【摘要】 脑肿瘤干细胞的分离和培养已获得成功，但它的起源细胞、起源机制是什么目前尚未明了。本文在简单介绍脑肿瘤干细胞发现过程的基础上，对有关它起源的研究进展作一综述并初步探讨寻找脑肿瘤干细胞的临床意义。
【关键词】 脑肿瘤 脑肿瘤干细胞 神经干细胞
脑肿瘤是神经外科最常见疾病之一，特别是胶质瘤，不仅发生率高，而且恶性度高，发展迅速，复发率极高。虽然围绕脑肿瘤的治疗手段有手术、放疗、化疗以及免疫治疗，但长期以来脑肿瘤患者生存率没有明显改善，其根本原因是无法完全清除肿瘤细胞。近年来发现，肿瘤组织中存在可以自我更新、增殖的细胞，这类细胞在肿瘤发生、发展、侵袭、转移及耐药等生物学特性中起主要作用，被称为肿瘤干细胞（tumor stem cells,TSC），正是肿瘤干细胞的存在使得肿瘤一旦无法全切便极易复发。脑肿瘤中也存在肿瘤干细胞［1］，因此治疗脑肿瘤必须以清除脑肿瘤干细胞为目标，但是，目前对脑肿瘤干细胞的起源及机制知之甚少，如何查找和有效杀伤脑肿瘤干细胞尚在研究当中。
1 脑肿瘤干细胞的发现
最早提出脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cells，BTSCs）的是Singh等［1］，他们用分离神经干细胞（neural stem cell，NSC）的技术分离各型胶质瘤细胞，然后把这些瘤细胞置于无血清神经干细胞培养液中培养，结果发现只有表达神经干细胞标志物巢蛋白（nestin）和CD13的瘤细胞能生长成肿瘤球，外形类似神经干细胞球，其他细胞则贴壁生长，不形成肿瘤球。将这些肿瘤球分离出来，制成细胞悬液，再通过有限稀释置于96孔板培养（最低密度为每孔1个细胞），所有由肿瘤球制成的细胞悬液都再次形成了肿瘤球，而且与原肿瘤球在形态和细胞成分上无差异，如果将这些肿瘤球进行传代培养，肿瘤球体积会不断增大，这些现象说明表达nestin+和CD133+的细胞具有自我更新和增殖的能力。为了证明这些nestin+和CD133+的肿瘤细胞不是被污染的神经干细胞，Singh等在一定条件下诱导这些细胞分化，结果分化形成的肿瘤细胞群无论在细胞成分和细胞比例上均与原肿瘤接近，而与神经干细胞分化结果：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞各占一定比例的现象不符。此外他们还检测到这些nestin+和CD133+细胞存在10号和16号染色体缺失、18号染色体增加的现象。因此他们得出结论：胶质瘤中存在少数具有干细胞特性的肿瘤细胞，这些细胞具有自我更新，无限增殖和多向分化能力，胶质瘤的各类细胞成分正是由这些有干细胞特性的瘤细胞分化而来，可称之为BTSCs。他们进一步将从髓母细胞瘤中分离得到CD133+和CD133-的细胞植入NOD/SCID小鼠体内，结果仅100个CD133+细胞就能在小鼠体内形成肿瘤，而50 000～100 000个CD133-细胞仍不能导致肿瘤发生［2］，这为BTSCs的存在提供更为有力的证据。
2 BTSCs起源细胞探讨
BTSCs的发现为脑肿瘤的诊断和治疗提供了新思路，对脑肿瘤诊断和治疗的核心将会集中到如何查找和杀灭BTSCs中来。但是，BTSCs的起源细胞尚未确定，BTSCs是脑肿瘤产生的原因还是脑肿瘤发展的结果，还有待进一步的探究。因此，BTSCs的起源问题已成为脑肿瘤研究的热点，目前提出了几种假说。
2.1 BTSCs来源于NSC
2.1.1 各位学者的观点 Hanahan等［3］认为，单一细胞经4～7次突变就有可能发生恶性转变，组织更新越快，复制、转录过程中发生基因突变的概率就越高。神经干细胞是中枢神经系统最活跃的细胞，长期处于分裂、增殖状态，容易发生突变，因此突变的NSC极有可能转变为BTSCs。Shiras等［4］在体外不断传代培养神经干细胞系HNGC-1，经多次传代后，部分细胞发生了转化，增殖速度较HNGC-1细胞更快，并且具备干细胞自我更新和无限增殖的特性。Shiras等将它们命名为HNGC-2，随后检测这两个细胞株的致瘤性，他们分别将107个HNGC-1和HNGC-2细胞注入裸鼠体内，结果，注入的HNGC-1细胞没有形成肿瘤，而注入的HNGC-2细胞形成了较大的分叶状肿瘤。为了进一步分析HNGC-1和HNGC-2在脑内形成肿瘤的可能性，他们将107个HNGC-1细胞注入裸鼠颅内，结果2个月后仍未观察到颅内有肿瘤形成，免疫组化也证实脑内没有肿瘤细胞存在，而将1 000个HNGC-2注入裸鼠颅内，6～8天后即形成了肿瘤，组织切片显示肿瘤具有恶性胶质瘤特征。Shiras等的实验是NSC可以转化为BTSCs的最有力证据。
2.1.2 BTSCs与NSC在生物学性状方面有极相似之处 具体表现在以下几个方面：（1）体外培养。BTSCs与NSCs一样，在无血清的培养基中维持未分化状态，添加bFGF、EGF后形成悬浮的球样结构，而在加有小牛血清的培养液中都会发生分化。（2）自我更新增殖能力。将亲本肿瘤球制成单细胞悬液，然后通过有限稀释置于96孔板培养，结果所有悬液都再次形成了肿瘤球，且与原肿瘤球完全一致，这表明BTSCs与NSC一样，具有强的自我更新能力。（3）定向分化。NSC能分化成为神经元和胶质细胞，这已经被证实，而实验也证明接种到严重联合免疫缺陷（SCID）鼠上的BTSCs形成的肿瘤包括亲本肿瘤中的各种细胞成分。Singh等［2］将BTSCs接种于鼠脑获得的瘤块与亲本肿瘤进行比较，发现髓母细胞瘤干细胞接种后，瘤细胞小而圆，细胞核深染；多形性胶质母细胞瘤干细胞接种后，瘤细胞表现出多形性，肿瘤血管很丰富，这些现像与亲本肿瘤一致。NSC可以分化出脑组织成分，BTSCs可以分化出脑肿瘤成分，这提示BTSCs与NSC可能同源。（4）NSC与BTSCs都有很高的端粒酶活性。早有研究表明，在端粒酶催化作用下，DNA端粒不断延长是细胞得以长期存活并增殖的原因。NSC本身存在高活性的端粒酶活性，很可能在较小的基因改变后就会失去增殖控制而转变为BTSCs。这些生物学方面的相似性表明，NSC与已分化细胞相比，只需要突变获得过度增殖能力就可成为BTSCs。
2.1.3 研究结果 正常情况下，干细胞更新受到严格控制，完成更新后相关的信号传导通路将关闭，如果持续受到刺激，这些通路将保持激活状态，干细胞就会处于不断分裂更新状态，发生基因突变几率也相应增大。随着突变积累，干细胞就会演变成能自我激活这些信号传导通路的肿瘤干细胞［5，6］。在研究NSC与BTSCs时发现，它们共同存在几条调控细胞增殖的信号传导通路：（1）Sonic hedgehog（shh）通路；（2）Wnt通路；（3）Bmi-1通路；（4）在NSC自我更新的分化过程中，一个名为PTEN的抑癌基因发挥着重要作用，新近的研究［7］表明，该基因的改变是BTSCs产生的关键事件。这些通路的存在，说明NSC与BTSCs之间有特殊的渊源关系，很可能是一脉相承的，只是从NSC到BTSCs这些通路在调控方面发生的关键分子事件尚不为我们所知。
2.1.4 干扰NSC基因可诱导脑肿瘤形成 Knoepfler等［8］发现，干扰小脑外颗粒层干细胞内的Sonic hedgehog（shh）通路，可诱导生成髓母细胞瘤；Dai等［9］将Ras、Akt基因导入神经祖细胞和星形胶质细胞，发现只有转入神经祖细胞才能导致肿瘤产生。有实验表明，转染了致癌基因的神经干细胞在小鼠中长出脑肿瘤，而在脑肿瘤组织中找不到NSC［10］，因此推测，这些被转染的NSCs转变成为了BTSCs。
2.1.5 NSC本身就具有向多种细胞谱系分化能力 在一些脑胶质瘤中，如多形胶质母细胞瘤、神经节胶质细胞瘤、胶质肉瘤，出现多个肿瘤细胞谱系，如神经节细胞瘤中，除了有瘤性神经元外还有许多瘤性星形细胞；胶质肉瘤中，除了有瘤性胶质细胞外还有肉瘤细胞，这用单一细胞起源难以解释，这些不同谱系的细胞或许各自起源于同名的已分化细胞，但更可能是由NSC发生突变转变成的BTSCs分化而来，因为NSC本身就具有向多种细胞谱系分化能力。
2.2 BTSCs起源于突变的已分化脑组织细胞，如神经元或胶质细胞
2.2.1 形态学依据 早在20世纪20年代，Bailey在显微镜下观察脑肿瘤细胞就发现，星形胶质瘤细胞形态像星形细胞，少突胶质瘤细胞形态像少突胶质细胞，而高度恶性的胶质母细胞瘤细胞则像低分化的前体细胞。现在的显微电镜和免疫组化技术也证实这一点。到目前为止，肿瘤的病理诊断仍然是通过观察肿瘤细胞与正常组织细胞在形态上的相似性来确定其来源。
2.2.2 基因水平依据 Uhrbom等［11］研究发现：已分化的星形胶质细胞在缺失肿瘤抑制位点INK4a-ARF后，可去分化为神经前体细胞，在致癌因素作用下极易产生恶性转化引起神经胶质母细胞瘤。另外，Tchougounova等［12］发现小鼠INK4a-ARF基因座的缺失后，发生星形细胞来源的肿瘤的几率显著上升。这些实验表明，已分化脑组织细胞发生了基因改变可以产生脑肿瘤，间接说明它们能转变为BTSCs。DNA半保留复制理论认为，DNA在复制过程中发生的碱基配对错误首先发生在新合成链而不是模板链［13］，NSC分裂时模板链总是留在新产生的NSC中，而有碱基错配的新链则传至神经元或胶质细胞，直至这两种细胞分化衰老死亡而清除。NSC的这种分裂特点是为了使基因突变不在NSC中积累，但是这样却使突变存在于已分化细胞内的几率高于NSC，如果一次性发生错配的碱基较多，这些神经元或胶质细胞就有可能发生去分化而转化为BTSCs。
3 寻找BTSCs来源的临床意义
BTSCs发现后，大多数学者支持脑肿瘤的形成、存在、增长由BTSCs决定的观点，因此，从BTSCs入手研究脑肿瘤的起源细胞、分子病因、侵袭与播散、耐药性是脑肿瘤研究的关键，但是在BTSCs起源问题没有解决前，研究这些问题受到限制，因此明确BTSCs的来源有重要意义。
3.1 脑肿瘤病因研究的对象转移 以往对肿瘤的研究以肿瘤细胞为对像，通过观察肿瘤细胞基因改变的特点及与遗传、环境等危险因素的相关程度来推测肿瘤发生的病因。BTSCs起源细胞明确后，对脑肿瘤的病因研究将以BTSCs来源细胞为主要对象［14］，这样就能从起源探讨脑肿瘤发生发展的规律，为更好地预防、治疗脑肿瘤提供有力的依据。
3.2 研究BTSCs起源细胞在向BTSCs转化过程中出现的特异性标志物，为预防和早期发现脑肿瘤提供依据 另外，脑肿瘤的病理类型及恶性级别与BTSCs相关，而BTSCs表型与其来源细胞必定存在关联，因此脑肿瘤的病理诊断将不能单纯由肿瘤细胞表型决定，而应由BTSCs及其起源细胞决定。
3.3 找到BTSCs起源细胞的作用 找到BTSCs起源细胞不仅对目前证据尚不十分充分的BTSCs学说是最有力的支持，而且对有关脑肿瘤生长规律、形态学特点的一些问题能很好地解释，如：胶质瘤呈浸润生长、恶性度高、一般不侵犯颅骨，而脑膜瘤多呈球状生、恶性度低，但却容易侵犯颅骨；I级胶质细胞瘤病人术后10年生存期可达100％，而IV级胶质细胞瘤病人术后生存期徘徊在1年左右［15］；还有，多数脑肿瘤都是单一细胞谱系，而在多形胶质母细胞瘤、神经节细胞瘤、胶质肉瘤却存在多种细胞谱系。脑肿瘤的这些现象与BTSCs及其来源细胞的生物学特点必定是相关的，因此，只有弄清BTSCs的起源过程才能很好地解释。
3.4 BTSCs提出以后，针对脑肿瘤的治疗必定集中到如何杀灭BTSCs上来［16］ 明确BTSCs来源及发生机制，对今后脑肿瘤治疗策略的制定起到至关重要的作用。可以在基因水平、蛋白水平、细胞水平对BTSCs及其起源细胞进行干预，起到预防、逆转、杀灭脑肿瘤的作用。例如，可借助起源细胞信号传导的研究成果，帮助发现BTSCs的信号传导靶位，诱导肿瘤干细胞的凋亡和阻止肿瘤干细胞的分化。
3.5 BTSCs的来源问题关系到NSC移植的安全性问题 如果BTSCs来源于NSC，那么NSC移植无疑是危险的，那就要求先明确NSC向BTSCs转化的机制，对移植的NSC分化加以调控，防止移植的NSC发生恶变。如果BTSCs的来源与NSC无关，那么推广应用NSC是安全的。
4 展望
目前对BTSCs的研究主要还是如何分离、鉴定BTSCs，有关BTSCs的起源问题只是推测，不管是NSC起源学说还是已分化细胞起源学说都没有直接证据。在寻找BTSCs的路途上，还有许多困难要解决：BTSCs的特异性标志物还未找到；BTSCs与NSC和已分化脑组织细胞在基因上存在哪些本质差别?基因突变是目前认为的BTSCs形成的最可能原因，但是最关键的基因突变是哪些？它们的表达产物如何作用？有没有一种方法能使单个NSC或已分化脑组织细胞发生恶性转变并检测到这个被转化的细胞就是BTSCs。BTSCs在脑肿瘤病因学、病理学、诊断学、治疗学等方面潜在极为重要的意义，对它起源研究的投入必将会越来越多，随着高密度基因芯片、差异PCR、大规模DNA测序、蛋白质二维凝胶电泳等技术的发展，一定能找到正常脑组织细胞、NSC、BTSCs三者之间的关键的基因差异、表达差异，进而揭开BTSCs起源之谜。
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（编辑：江 宇）
作者单位：530021 广西南宁，广西医科大学第一附属医院神经外科