诊断级超声对胎鼠血管内皮细胞Bcl-2表达的影响

【摘要】  目的 观察一定剂量诊断级超声波短时间照射胎鼠血管内皮细胞时，对其Bcl-2蛋白表达的影响。方法 采用孕14天的Wistar大鼠20只，设立实验组与对照组，实验组用7.5 MHz的超声波照射胎鼠10 min，利用免疫组化法检测胎鼠血管内皮组织Bcl-2蛋白的表达，用TUNEL法检测血管内皮细胞的凋亡。对照组采用假照射，其余处理同实验组。结果 实验组胎鼠血管内皮可见大片状Bcl-2蛋白阳性细胞，对照组弱于实验组；TUNEL试验显示两组血管内皮细胞凋亡情况差异无显著性（P>0.05）。结论 诊断级高频率超声波短时间照射可导致胎鼠血管内皮细胞表达Bcl-2蛋白增加，参与抑制细胞凋亡。

【关键词】  超声；凋亡；Bcl-2；血管内皮细胞；胎鼠

    Diagnostic ultrasound effects on expression of Bcl-2 protein in fetal ratvascular epithelial cells

    MO Xiao-lan，XIA Guo-yuan，SUN Jian-gang，et al.Medical College Shaoxing University,Shaoxing 312000，China

    ［Abstract］  Objective  To observe whether the short-irradiation dose of diagnostic ultrasound affects Bcl-2 protein expression in fetal rats vascular epithelial cells.Methods  20 Wistar rats were pregnant for 14 days and the experimental group and control group were set up.The fetal rats were irradiated for 10 minutes using 7.5 MHz ultrasound in the experimental group.The apoptotic status and the expression protein of apoptotic related gene Bcl-2 were detected by terminal-deoxynucleotidyl mediated nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry method.The control group exposed to other treatments same as the experimental group.Results  The experimental group organized a large flake of Bcl-2 protein in fetal rats vascular epithelial cells while the control group was not so obvious.TUNEL test showed no significant difference of apoptosis in both two groups (P>0.05).Conclusion  A short time irradiation with high frequency diagnostic ultrasound on fetal rats vascular epithelial cells may lead to increasing expression of Bcl-2 protein which stops cells to apoptosis.

    ［Key words］  ultrasound;apoptosis;Bcl-2;vascular epithelial cell;fetal rat

    长时间高频率诊断级聚焦超声照射可诱导胚胎细胞凋亡已有报道［1］。杜联芳用诊断超声对大鼠幼仔睾丸组织凋亡情况进行了研究，应用HP 8500彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5 MHz、空间平均时间平均声强Isapa为3.4 W/cm2，照射时间为30 min，结果发现实验组与对照组细胞凋亡数有显著差异［2］。

    已知Bcl-2蛋白是一类细胞凋亡抑制因子，可拮抗凋亡促进因子Bax的作用。Bcl-2家族有众多成员，如Mcl-1、NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它们分别既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多数成员间有两个结构同源区域，在介导成员之间的二聚体化过程中起重要作用。Bcl-2成员之间的二聚体化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，在一些白血病中Bcl-2呈过度表达［3］。本实验旨在研究在短时间诊断级超声作用下，胚胎是否可增加Bcl-2表达。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  健康成熟的孕14天的Wistar大鼠20只（浙江大学实验动物中心提供），随机分为两组，Ⅰ组为实验组，Ⅱ组为对照组，每组10只孕鼠。孕鼠仰卧固定于架子上，于下腹部外涂耦合剂，沿孕鼠子宫部位的体表投影区用频率为7.5 MHz的探头缓慢滑行照射，照射时间为10 min，对照组进行假照射，其余处理相同。

    1.2  仪器及试剂  用迈瑞DP8800型二维超声诊断仪，探头频率7.5 MHz，Isppa=127 W/cm2，Ispta=385 mW/cm2，全部声学参数由迈瑞公司提供。所用试剂包括：TUNEL试剂盒（武汉博士德公司）、免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），兔抗Bcl-2抗体（武汉博士德公司）。

    1.3  实验方法

    1.3.1  标本的留取  孕鼠照射处理后24 h剖腹取胎，每只孕鼠按照相同空间位置取2只胎鼠，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后连续冠状切片。

    1.3.2  Bcl-2蛋白的免疫组化染色  每只胎鼠任取2张胚胎切片。组织切片常规脱蜡，梯度酒精脱水后，3%H2O2孵育，抗原修复液修复，羊血清封闭。Bcl-2抗体孵育，羊抗兔IgG孵育，ABC复合物孵育，DAB显色，苏木素轻度复染。光镜下观察，细胞质着棕黄色者为阳性细胞。

    1.3.3  TUNEL法检测细胞凋亡  每只胎鼠任取2张胚胎切片。石蜡切片常规脱蜡脱水后，3%H2O2孵育，蛋白酶K消化，TdT、DIG-dUTP及标记缓冲液1∶1∶18混合加于切片上标记，加封闭液、封闭液1∶100稀释的生物素化抗地高辛抗体及TBS液1∶100稀释的SABC，DAB显色，苏木素轻度复染。光镜下观察，细胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。

    1.4  统计学方法  所有数据采用SPSS 11.0软件进行处理，采用样本均数比较的方差分析，当P<0.05时为统异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  Bcl-2蛋白免疫组化结果  细胞质出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞。评分标准：按着色强度评分，无着色0分，浅黄色1分，浅棕色2分，深棕色3分；按阳性率评分，<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将阳性率和着色强度两项评分乘积进行评价，结果分为3级：0～4分为阴性表达（-）；5～8分为弱阳性表达（+）；9～12分为强阳性表达（++）。光镜下观察并使用SPSS 11.0统计软件，采用样本均数比较的方差分析统计后得出，同一样本不同胚胎间无明显差异（P>0.05），实验组胎鼠血管内皮可见大片状Bcl-2蛋白强阳性细胞，为（+）（图1），对照组为(-)（图2）。

    2.2  细胞凋亡结果  每例切片随机取400倍视野，随机计数1000个细胞，以平均每100个细胞内所含阳性细胞数作为凋亡指数（AI），使用SPSS 11.0统计软件，采用样本均数比较的方差分析显示：同一样本不同胚胎间无明显差异（P>0.05），实验组与对照组无明显差异（P>0.05），两组胚胎血管内皮细胞相比凋亡改变现象不明显（表1）。 表1  胎鼠血管内皮细胞凋亡指数(AI)及Bcl-2的表达结果

    3  讨论

    Bcl-2生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，在一些白血病中Bcl-2呈过度表达［3］。但Bcl-2既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。另一方面，长时间高频率诊断级聚焦超声照射可诱导生物体细胞凋亡，所以我们在想：在超声照射处理早期，机体是否可以产生自身保护反应，增加Bcl-2表达来抑制细胞凋亡呢？因此我们用免疫组化法及TUNEL法进行实验，发现用频率为7.5 MHz的探头滑动照射10 min，可导致大鼠对超声波较敏感的血管内皮细胞表达Bcl-2明显增加，而此时凋亡细胞数量尚无明显改变。我们的实验说明了诊断级高频率超声波短时间照射可导致胎鼠血管内皮细胞表达Bcl-2蛋白增加，参与抑制细胞凋亡。说明至少在某些胚胎组织，在超声波生物效应的作用下，可能存在着凋亡前的保护机制来抑制细胞凋亡的进行，但如果生物效应的强度继续加大，则细胞凋亡将不可避免［4］。

    一些实验表明，低剂量超声能促进细胞的增殖［5］。Doan对超声处理后的成纤维细胞、下颌成骨细胞增殖情况也进行了研究。用频率为45 KHz(声强为30 mW／cm2、15 mW/cm2)的超声和频率为1 MHz(声强为100 mW/cm2、400 mW/cm2)的超声分组照射，发现细胞增殖加速，频率为45 KHz组更明显［6］。但是超声导致细胞增殖的机制一直没有明确的结论。我们的实验也发现实验组胎鼠血管内皮可见大片状Bcl-2蛋白强阳性细胞，而对照组则为阴性。实验组与对照组细胞凋亡结果无明显差异（P>0.05），两组胚胎血管内皮细胞相比凋亡改变现象不明显。故实验说明一定剂量的超声波可以促进Bcl-2表达来抑制细胞凋亡，但是否是导致低剂量超声促进细胞增殖的原因之一呢？相关的机制值得我们进一步探索。

   

【参考文献】
  1 程颜芩，段云友，田蓉，等.超声照射后胎鼠脑FOS蛋白的表达与细胞凋亡的关系.中华超声影像学杂志，2003，12（4）：245-246.

2 杜联芳，张青萍，刘望彭.诊断超声与细胞凋亡.中华超声影像学杂志，2000，9(6)：374-376.

3 Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis.Nature，2000，407(12)：770.

4 夏国园，苏巧荣.诊断级超声对活鼠胚胎生物学效应的研究进展.实用放射学杂志，2004，20（6）：554-555.

5 Reher P，Doan N，Bradnock B，et al.Therapeutic ultrasound for osteoradionecrosis：an in vitro comparison between 1 MHz and 45 kHz machines.Eur J Cancer，1998，34(12)：1962-1968.

6 Doan N，Reher P，Meghji S，et al.In vitro effects therapeutic ultrasound on cell proliferation，protein synthesis，and cytokine production by human fibroblasts，osteoblasts，and monocytes.J Oral Maxillofac Surg，1999，57(4)：409-420.

作者单位：312000 浙江绍兴，绍兴文理学院医学院