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【摘要】 目的 建立前列腺癌早期诊断方法。方法 培养前列腺癌LNCaP细胞，提取LNCaP细胞总RNA， RT-PCR扩增前列腺特异抗原(Prostate Specific antigen, PSA)基因，用洋地黄毒苷标记PSA DNA，通过二次酶放大和时间分辨荧光测量技术测定靶PSA DNA。 结果 成功培养了LNCaP细胞，提取的总RNA浓度为1701μg/μl，OD260/OD280=2.1404(>2.0)，纯度很好，经RT-PCR成功的扩增出了PSA基因，将扩增DNA用于核酸杂交的二次酶放大时间分辨荧光分析中，结果靶PSA DNA测定的标准曲线线性范围大于两个数量级，灵敏度为10pmol/L，当靶PSA DNA浓度为10、30和60 pmol/L时，准确度和精密度分别为77%~95%和12.9%~15.3%。结论 本研究为以PSA基因为靶标的前列腺癌早期诊断新方法的研究奠定了坚实的基础。
【关键词】 前列腺特异抗原;RT-PCR;时间分辨荧光分析
Application of prostate cancer cell LNCaP in nucleic acid hybridization
CHU Li-ping, SONG Na-ling，LIU Jian-Feng,et al. Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science , Peking Union Medical College, Tianjin Key laboratory of Molecular Nuclear Medicine, Tianjin 300192, China
Objective To establish the early diagnosis method of prostate cancer. Methods The prostate cancer cell LNCaP was cultured, then we extract the RNA , the Prostate Specific Antigen(PSA)DNA was amplified by RT-PCR,during the RT-PCR the digoxigenin(DIG)was labeled.We detected the concentration of PSA DNA by two-round enzyme-amplified and time-resolved florescence assay technology.Results The LNCaP cell was cultured successfully; The concentration of extracted RNA is 1701 μg/μl，OD260/OD280=2.1404(>2.0); The PSA DNA was amplified by RT-PCR and used in the analysis of two-round enzyme-amplified time-resolved fluorescence assay, the range of the standard curve for detecting target PSA DNA was more than two order of magnitude; the sensitivity was 10 pmol/L; the accuracy and the precision was 77%~95% and 12.9%~15.3% respectively when the target PSA DNA was 10,30 and 60 pmol/L.Conclusion This investigation provides an foundation of new methods of early diagnosis for prostate cancer.
[Key words] prostate specific antigen; RT-PCR;Ttime-resolved fluorescence assay
前列腺癌是老年男性最常见的恶性肿瘤之一，前列腺特异抗原(Prostate Specific antigen, PSA)是由人类前列腺上皮产生的一种丝氨酸蛋白酶，最初由Hara等于1971年从人类精浆中发现，1979年Wang等再次从前列腺上皮细胞中分离和提纯出来，并证明其是前列腺特异的。前列腺癌细胞株LNCaP，PC-3和DU145都来自转移性前列腺癌，但只有LNCaP株有较高的PSA表达[1，2]。本实验即选择了前列列腺癌LNCaP细胞株[3]，建立了成熟的LNCaP细胞株培养方案，通过RT-PCR方法成功的扩增得到前列腺特异抗原PSA基因，并用于核酸杂交的二次酶放大时间分辨荧光分析中，对临床前列腺癌的早期诊断和发现具有非常重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂 前列腺癌细胞株LNCaP Cell Line, RPMI-1640培养基，进口胎牛血清，谷氨酰胺，丙酮酸钠，胰蛋白酶，EDTA购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心;Trizol试剂，RT-PCR试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司;上游引物：5' CTC TCG TGG CAG GGC AGT CT 3'，下游引物：5' GGT CGT GGC TGG AGT CAT CA 3'由上海申能博彩科技公司合成;Dig-11-dUTP alkali stable购自 Roche公司;Gene Ruler TM100bp DNA ladder购自permentas公司; Taq DNA polymerase购自Promega公司。
1.2 仪器 日立低温高速离心机;德国Sartorius公司1 /100000 电子分析天平;美国Beckman公司DU-800型紫外分光光度仪;瑞典Pharmacia Biotech公司水平电泳仪;美国Thermo公司PCR扩增仪;美国Bio-Rad公司Gel Doc 1000凝胶成像仪;芬兰LKB-Wallac公司时间分辨荧光仪。
1.3 方法
1.3.1 LNCaP细胞培养 用含10%进口胎牛血清的RPMI1640培养基加入1%L-谷氨酰胺、1%双抗和1%丙酮酸钠为培养液，在37℃、5%CO2培养箱内培养，用0.25%胰酶和0.03%EDTA的混合液消化传代。实验中发现该细胞贴壁困难，细胞与细胞间连接紧密，倍增时间长，生长缓慢，所以消化时间较一般的肿瘤细胞株长，需要充分吹打，传代时细胞浓度不可太低，否则细胞传代后生长状态不好，并且传代后2~3天内最好不要移动培养瓶，以保证细胞充分贴壁。此外，该细胞株对血清的要求也比较高，经比较，用含10%进口胎牛血清的RPMI1640培养细胞，细胞生长状态良好，而更换为含10%新生牛血清的RPMI1640培养细胞时，其生长速度则显得极为缓慢。
1.3.2 LNCaP细胞总RNA提取 培养LNCaP细胞至对数生长期，离心收集，PBS洗2次，计数，每管1 ml约含1×107个细胞，按Trizol试剂说明书操作步骤提取总RNA，全过程严格在无RNase下操作，从一管中取3μl,用0.1%DEPC水稀释至30μl,用紫外分光光度计测定波长在260nm和280nm处的吸光度，最后计算总RNA浓度和纯度。将提取得到的总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定提取总RNA分子的完整性。
1.3.3 PSA cDNA的合成 以4μg总RNA为模板，使用RT-PCR试剂盒按说明书合成cDNA第一链，反应体系中加入dNTP混合物及随机引物，65℃加热5min，冰浴1min，42℃ 温育50min(cDNA的合成)，最后70℃ 15min终止反应。
1.3.4 DIG标记PSA cDNA和PSA cDNA的PCR扩增 dTTP是DNA聚合酶、Taq聚合酶、末端转移酶和反转录酶的底物 在PCR中，Dig-11-dUTP可以代替作为Taq聚合酶底物的dTTP。Dig-11-dUTP结合到PCR产物，不仅实现了Dig-11-dUTP对DNA的标记，而且能高灵敏地分析这种产物，其中Dig-11-dUTP对dTTP的摩尔比为1：19就足够，本实验我们用的是1：20，以上一步产物PSA cDNA为模板，进行PCR扩增，体系总体积为50μl，其中含Taq酶0.4μl, TaqBuffer 5μl, dNTP 1μl, 1nM/μl 的Dig-11-dUTP 0.5μl，上下游引物各2μl和cDNA 2μl,25mM MgCl2 3μl,灭菌水34μl，反应条件为：首先94℃加热4min，然后94℃ 2min ，62℃ 1min ，72℃ 1min进行30个循环 ，最后72℃延伸10 min。
1.3.5 PCR扩增产物DNA的鉴定 应用紫外吸收法，按下式计算浓度：DNA浓度(μg/ml)= OD260/(0.020× L)×稀释倍数, 式中L=1, 0.020为每ml 溶液中含1μg DNA的光吸收值。再用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定此扩增产物纯度。
1.3.6 核酸杂交的二次酶放大时间分辨荧光分析 先用抗DIG抗体包被微滴定孔，将DIG标记的靶PSA DNA连接到抗体上,然后用生物素化探针与靶DNA杂交，再通过生物素(B)与链霉亲和素(SA)的反应，将链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP-SA)连接到杂化物上,加入含有H2O2和生物素化酪胺(B-T)的HRP的底物溶液，因有H2O2 存在，HRP在此催化酪胺氧化，产生游离集团的同时，也催化事先固定在微滴定孔表面的蛋白质的酪胺酰基的氧化，由于二聚体形成反应，于是B-T就共价地结合到固相上,再加入碱性磷酸酶标记链霉亲和素(ALP-SA)，经B与SA的反应，ALP结合到固相上,洗涤后，加入ALP的底物5-氟水杨酸磷酸酯(5-FSAP)，ALP作用于5-FSAP，产物为5-氟水杨酸(5-FSA)，再加入荧光发展溶液，5-FSA与发展溶液中的Tb和乙二胺四乙酸(EDTA)形成5-FSA：Tb：EDTA三元复合物，它在氙灯和氮激光激发下，能发射高产额的长寿命荧光，不用分离，直接用时间分辨荧光仪测量荧光强度，这荧光强度与靶DNA量成正相关，由荧光强度确定靶DNA量。
2 结果
2.1 培养LNCaP细胞、提取总RNA浓度及纯度结果 成功培养9瓶LNCaP 细胞并发分装成9管，每管1 ml约含1×107个细胞，提取的总RNA取小样稀释40倍经紫外分光光度计测定OD260=1.0206，OD280=0.4768，OD260/ OD280=2.1404(>2.0)，说明RNA纯度符合要求，根据公式RNA总浓度= OD260/(0.024× L)×稀释倍数,式中L为光程,本实验所用仪器L 为1cm,计算出RNA总浓度为1701μg/μl 。总RNA抽提产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统拍照可见清晰的两条带，分别是28S和18S(见图1)，并且28S、18S两条带亮度之比接近2:1，说明RNA分子比较完整。
图1 提取总RNA电泳图
2.2 PSA cDNA的PCR扩增 PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物长度与目的基因理论值233bp一致(见图2)。
图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
2.3 核酸杂交的二次酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析 制备出下列试剂和溶液[4]：(1)HRP-SA;(2)B-T及HRP的底物溶液;(3)ALP-SA;(4)5-FSAP及ALP的底物溶液;(5)Tb-EDTA 螯合物及荧光发展溶液。通过实验确定了分析系统的最佳条件为：紫外灯照射时间为40 min;HRP-SA连接物浓度为0.6mg/L; HRP-SA结合到固相上生物素化杂化物时间为15 min;生物素化PSA探针浓度为82μg /L; B-T浓度为0.1mM/L; ALP-SA浓度为500U/ml; 过氧化物酶底物溶液中的H2O2 浓度为2mM/L; 5-FSAP浓度为2mM/L ;靶PSA DNA浓度为60pM/L.由此作出此分析系统的标准曲线(见图3)。图3 信/噪比随靶PSA DNA浓度变化的标准曲线由图3可见，在5～100pmol/L靶PSA DNA时，未见曲线有饱和趋势，因此，标准曲线范围至少在2个数量级。当靶PSA DNA浓度为10、30和60 pmol/L时，准确度和精密度分别为77%~95%和12.9%~15.3%。
3 讨论前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，根据资料显示，前列腺癌发病率和病死率存在明显的地区差异，美国、北欧、西欧和澳洲是前列腺癌的高发地区，而亚洲和北美是相对低发地区。但前列腺癌低发地区从20世纪70年代起发病率已从1991年的2.9/10万男性(标化率2.4/10万)上升到2001年的12.14/10万男性(标化率6.78/10万)。肿瘤的早期筛查和诊断对提高患者的存活机会和生活质量都具有非常重要的意义[5]。目前PSA作为一种无创简便的检测手段已被广泛应用于前列腺癌的诊断[6]。对PSA基因进行扩增，并研究更灵敏、方便的检测方法对前列腺癌的临床早期诊断具有非常重要的意义[7]。本实验建立了成熟的LNCaP细胞株培养方案，通过RT-PCR方法成功的从前列腺癌细胞株LNCaP中扩增得到前列腺特异抗原PSA基因。通过一系列试剂研制和反应条件的优化，建立了以PSA DNA为诊断目标的核酸杂交的二次酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析系统，它与其他镧系元素发光分析系统比较有几大优点：(1)灵敏度高，这是因为把二次酶放大、PCR扩增、镧系元素螯合物固有优点以及时间分辨和波长分辨测量技术集为一体;(2)分析系统非常简捷，全过程操作一管到底，不需要电泳、Southern转移和膜杂交等复杂费时的步骤，分析快速，易于自动化;(3)试剂的有效期长;(4)安全无污染，抗干扰能力强，环境改变和萃灭体对荧光特征发射影响极小。这些优点使本分析系统进入常规应用成为可能，具有很大发展潜力和实用价值，为前列腺癌早期诊断新方法的研究奠定了基础。
【参考文献】
1 Montgomery BT, Young CY, Bilhartz DL, et a1. Hormonal regulation of prostate-specific antigen (PSA) glycoprotein in the human prOStatic adenocarcinoma cell line LNCaP. Prostate，1992, 21(1): 63-73.
2 Eissa S, Shoman S. Markers for early detection of cancer In : Tumor marker. New yark: Chapman & Hall, 2000：207-216.
3 罗勇，贺大林. 前列腺癌细胞株LNCaP和IA8中转移相关蛋白的差异表达及意义. 中华男科学杂志, 2006, 12(3): 230-233.
4 宋娜玲,赵启仁,李美佳,等. 酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析中关键试剂的研究. 中华医学研究杂志，2006, 6(12):1321-1323.
5 Partin AW, Brawer MK, Bartseh G, et a1., Complexed prostate specific antigen improves specificity for prostate cancer detection: results of a prospective multicenter clinical trial. J Urol，2003, 170(5): 1787-1791.
6 顾平, 盛世乐, 黄钢. PSA及其它肿瘤标志物在前列腺癌中的应用. 放射免疫学杂, 2006，19(6): 507-512.
7 邹雄. 肿瘤标志在肿瘤早期诊断中的研究与应用进展. 中华检验医学杂志, 2002, 25(2): 71-72.