结直肠癌水成像MSCT征象与p53、Ki67基因表达的相关性研究

【摘要】  目的探讨结直肠癌水成像MSCT征象与p53、Ki67基因表达的关系。方法32例结直肠癌患者，术前均行MSCT水成像双期增强扫描，并采用免疫组织化学方法染色检测p53、Ki67抗原表达及手术病理对照分析。结果MSCT判断结直肠癌肿瘤侵出浆膜肠外浸润的准确率为85.7%,判断区域性淋巴结转移的准确率为61. 5%;结直肠癌侵出浆膜肠外浸润组的p53表达62.6%、Ki67表达74.5%高于肠壁浸润组的54.1%、63.2%,二者比较呈显著性相关,(P值均<0. 05), 伴有淋巴结及远处转移组的p53表达65.8%、Ki67%表达76.2%，高于无淋巴结及远处转移组53.6%、64.7%，二者比较呈显著性相关(P值均<0. 05) 。结论结直肠癌侵袭性的MSCT征象可以一定程度反映p53 、Ki67两种基因的表达强度。可作为临床判断结直肠癌的恶性程度的一个分子影像学的重要指标。结、直肠癌侵袭性的MSCT征象与p53、Ki67两种基因检测相结合,可进一步提高对肠壁浸润的程度、区域性淋巴结转移和术前分期判定的正确性, 对结直肠癌的术前及预后评价有重要价值。

【关键词】  结直肠癌;p53，Ki67;免疫组织化学;体层摄影术;X线计算机

　　MSCT检查是目前诊断评价结直肠癌的主要方法;但在判断肿瘤肠壁浸润深度、淋巴结及远处转移有一定限度。结、直肠癌的发生和发展是涉及多基因、多步骤的复杂过程。肿瘤生物标志物p53、Ki67反映肿瘤的生物学特征。p53基因作为抑癌基因逐渐被人们认识,它通过参与细胞周围的负调控而调节细胞的增殖与分化，当发生缺失或突变后可促进细胞无限制生长，对肿瘤的发生发展起重要作用[1]。Ki67广泛表达于增殖期细胞而不表达于静止期细胞，是评估细胞增殖的较好指标[2]。本研究采用MSCT水成像双期扫描方法诊断结直肠癌;并采用免疫组织化学方法检测结直肠癌p53、Ki67抗原的表达情况及手术病理对照分析，探讨p53、 Ki67抗原表达与结直肠癌肠壁浸润、侵出浆膜肠外浸润及淋巴结转移侵袭性MSCT征象的相关性, 旨在从影像学角度评价p53、 Ki67基因在结直肠癌肠壁及肠外浸润、淋巴结转移等侵袭性生物学行为的价值。

　　1材料与方法

　　1.1病例资料随机搜集本院2010年1月—2011年8月间经手术病理证实资料完整的结直肠癌患者32例，年龄40~84岁，平均54.3 岁。其中男20例，女12例。升结肠癌6例，横结肠癌1例，降结肠癌5例，乙状结肠癌4例, 直肠癌17例;主要临床表现为腹痛、大便习惯改变、便血、腹部肿块等。

　　1.2多层螺旋CT检查方法采用Plips MX8000多层螺旋CT机，CT检查前常规禁食12h，并口服泻药清洁肠道，扫描前10im患者静脉注射低张药，经直肠灌注温水800~1000ml，并小心翻滚身体，使结直肠充分充盈。扫描范围以层厚3.2mm或6.5mm、间隔0.875mm，行膈顶至耻骨联合全腹部仰卧单一体位扫描,用高压注射器静脉团注优维显(300mgI/ml)80~100ml，3ml/s延时30s行动脉期上腹部肝脏扫描, 60s门脉期全腹部结肠增强扫描。在工作站获取容积数据的基础上,对兴趣区行曲面重组(PCR)水成像重建图像传输至PACS诊断。

　　1.3图像分析方法术前由2位资深放射科医师阅片，并以轴位结合CPR图像多方位观察确定：肿瘤病变部位、大小及形态;肿瘤对肠壁的浸润,有无浆膜面及肠外侵犯;有无肿大转移淋巴结及远处组织器官转移;并进行结直肠癌术前分期。

　　1.4免疫组化测定方法及结果判定

　　1.4.1检测试剂采用Dako公司提供的第一抗体Ki67(克隆号：MIB-1)、p53(克隆号：DO-7)，第二抗体即用型快捷免疫组化EnVision检测试剂盒，DAB显色液，柠檬酸缓冲液及自制PBS液。

　　1.4.2检测步骤p53及Ki67检测均采用EnVi-sion两步法，详细步骤严格按照说明书进行。

　　1.4.3结果判定p53、 Ki67阳性表达在胞核，呈现棕黄色颗粒， p53阳性为细胞核着色且呈棕黄色后黄褐色。Ki67阳性根据染色肿瘤细胞所占比例进行判定，阴性染色细胞数≥10%为阳性，免疫组化测定由杭州迪安生化检验公司完成。

　　1.5结肠癌肠外浸润的CT诊断标准[3,4]CT图像上病变处肠壁外缘光滑锐利，视为癌肿局限于肠壁内，肠壁浆膜面模糊不清或伴有外周脂肪密度增高，有条索状影伸入脂肪层内或在肠周脂肪层内形成明显的软组织结节或肿块者均视为肠外癌肿浸润。

　　1.6MSCT对淋巴结转移的判定[5]通常淋巴结的大小被认为是判断转移与否的一个标准，CT也沿用淋巴结直径>1.0cm为阳性指标。

　　1.7统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，采用Spearman秩相关分析各指标表达的相关性，P<0.05为差异有显著性。

　　2结果

　　MSCT检出了全部结直肠癌，敏感性100%。病理证实中分化腺癌24例,低分化腺癌2例,中-低分化腺癌2例，中分化腺癌部分黏液腺癌4例,黏液腺癌1例。本组其中1例直肠、降结肠两处肿瘤。MSCT判断肿瘤侵出浆膜有肠壁外浸润18例。术后病理对照证实, 肿瘤浸润至浆膜局限于肠壁内11例，肿瘤侵出浆膜肠外浸润21例，其中高估1例,低估3例, MSCT判断有肠壁浸润肿瘤侵出浆膜肠外浸润的准确率为85.7%。MSCT以直径>1.0cm的淋巴结作为结肠淋巴结转移的诊断标准，结果发现合并有淋巴或远处转移8例, 其中3例合并远处肝脏转移。MSCT未发现淋巴结转移的23例中，术后病理证实5例有转移为假阴性,其中3例为直径<5mm的微小淋巴结转移。MSCT判断有肠外淋巴结转移的准确率为61. 5%。采用DuKes分期法[6] ，标准为A期：癌肿侵犯黏膜或黏膜下层，浅肌层;B期：侵犯浆膜层/浆膜外;C期：淋巴结转移;D期：远处转移或腹膜转移。本组A期 2 例, B期17例, C期10例,D期3例。结直肠癌肠壁浸润、侵出浆膜肠外浸润、淋巴结及远处转移与P53、Ki67抗原阳性百分率比较(% ，〖x〗±s)的关系见表1。表1结直肠癌肠壁浸润转移CT征象P53、Ki67阳性表达

　　3讨论

　　3.1MSCT结直肠水成像及CPR技术应用的优势本研究扫描前采用低张水充盈法进行肠道准备，不仅可以使肠管充分扩张，在肠腔内水分及肠管周围脂肪组织的衬托下肠壁及肿瘤病变部位结构显示更清晰。尤其是通过CPR后处理技术的水成像重建图像，能准确地将肠袢皱襞与病变区分开，使结直肠肿瘤病变及相邻肠段完全拉直,可更直观地显示结直肠肿瘤的全貌,对病变定位、病变范围的测量明显优于单纯横断位。有报道大肠癌肝转移最常见,约占大肠癌血行转移的61.9%(直肠癌)～75.7% (结肠癌)[6] 。本组采用上腹部的双期增强扫描有利于观察肝脏及远处组织器官的转移,避免了转移病变的遗漏。笔者认为横断位结合CPR重组可更全面的了解病变范围，提高对病变定位、定性诊断的正确性。

　　3.2结直肠癌侵出浆膜肠外浸润CT征象与病理对照分析肠壁浆膜层是阻止癌细胞扩散转移的一个良好屏障，CT所见浆膜面是指组织学浆膜及邻近浆膜的肌层组织，浆膜面的光滑与否常作为判定肿瘤浆膜面是否受侵的直接征象。本研究以肿瘤侵至浆膜内,浆膜面光整的为肠壁浸润组,肿瘤侵出浆膜则为侵出浆膜肠外浸润组, 病理证实肿瘤一旦侵出浆膜则往往伴有肠外浸润。本组MSCT判断癌肿侵出浆膜肠外浸润18例;术后病理对照发现高估1例, 低估3例。 其中高估1例MSCT表现浆膜面毛糙相邻的脂肪组织内可见条索状密度增高影，但术后病理证实肿瘤未侵出浆膜，系肠周组织炎细胞浸润;原因可能为肿瘤本身浸润的同时，局部炎性反应致形成肠壁浆膜外脂肪间隙内索条状反应性增生,造成侵袭浆膜肠外浸润的假象。本组低估3例表现为局部增厚的肠壁外周光整，病灶周围有清晰的脂肪层，MSCT判断低估3例,但术后病理证实肿瘤已侵出浆膜,有浆膜外的脉管、神经浸润和系膜的微小癌结节;因此认为MSCT诊断肠壁浆膜面侵犯肠外浸润有一定的局限性，肠周组织局部反应性增生与浆膜面的受侵有时也难以鉴别, 尤其是无法检测到肠周脂肪间隙的微小浸润和系膜微小的癌结节(图1~4)。

　　3.3结直肠癌区域性淋巴结转移CT征象与手术病理对照分析结、直肠癌区域性淋巴结转移的判定一直是CT诊断的难点之一。传统CT多以直径超过10mm作为大肠癌淋巴结转移标准，而病理证明大肠癌的转移淋巴结有31%直径<4mm，反应性和炎性肿大的淋巴结又常与转移淋巴结难以鉴别[6]。本组以直径>1.0cm的淋巴结作为结肠淋巴结转移的诊断标准，病理证实13例阳性淋巴结转移的病例中有5例MSCT未能检出转移淋巴结，本研究显示MSCT判断结直肠癌区域性淋巴结转移的准确率仅为61.5%;较文献报道[6]稍低。其原因可能为部分小的转移淋巴结与肿瘤肠壁融合,特别是肠外微小的转移淋巴结MSCT无法检测到或难以断判，降低了敏感性(图5、6)。

　　3.4结直肠癌肠壁浸润、侵出浆膜肠外浸润与p53、Ki67表达关系肿瘤的发生、浸润和转移是个相当复杂的病理生理过程，其中涉及多种癌基因的激活与抑癌基因的突变和(或)失活。研究表明[7]p53基因位于17号染色体上，是一个非常重要的抑癌基因，有野生型和突变型之分，自然存在的野生型p53基因在细胞增殖周期中发挥保持细胞周期正常运转，调节细胞周期进程，诱导细胞凋亡的功能。突变型p53具有抑制癌细胞凋亡和促进细胞增殖的作用。它通过参与细胞周围的负调控而调节细胞的增殖与分化，当组织中有p53蛋白的高表达，即表明有p53基因的突变[8]。文献报道p53蛋白在大肠癌的表达率文献报道在40%～ 67%[9] 。本研究结直肠癌的p53总表达率为59.6%，符合文献报道。病变中p53表达强度较高，肿瘤细胞增殖生长更活跃,可以加速细胞增殖促进细胞无限制生长，促进肿瘤由肠壁及向肠外浸润侵袭性生长。编码Ki67的人类基因定位于第10号染色体的长臂上,Ki67抗原的表达在细胞的M期达高峰，其直接反映的是肿瘤细胞的增殖活性。Ki67广泛表达于增殖期细胞而不表达于静止期细胞，是一个较理想的评估细胞增殖活性的指标。研究表明Ki67作为敏感的细胞增殖相关核抗原，在多种肿瘤及癌前病变中均有异常表达，且与肿瘤的种植、浸润、转移潜能密切相关。肿瘤恶性程度越高，Ki67抗原表达水平越高。本研究结直肠癌肿瘤侵出浆膜肠外浸润组的p53表达为62.6%、Ki67抗原表达为74.5%高于肠壁浸润组的54.1%、63.2%,二者呈显著性相关。结直肠癌病变肠壁出现肠壁边缘毛糙、棘状突起或索条状影侵出浆膜肠外浸润CT征象者,其病变中p53、Ki67抗原表达强度较高, 说明肿瘤细胞增殖活性较高，癌肿的侵袭力强。恶性肿瘤的发生、浸润大部分依赖于肿瘤血管的形成与肿瘤侵袭相关的基因表达诱导生成大量结构功能异常的肿瘤血管，形成肿瘤生长浸润的基础。肠壁边缘毛糙、棘状突起或索条影的病理基础都是在肿瘤浸润生长的基础上,由于肿瘤血管的形成与肿瘤侵袭相关的基因表达诱导生成大量结构功能异常的肿瘤血管、肿瘤间质向瘤外浸润生长。当肿瘤细胞的高度增殖促进肿瘤细胞由肠壁向肠外侵袭性浸润生长时，导致加速肿瘤血管形成以改善局部供血，从而出现了大量结构和功能异常的肿瘤血管、肿瘤细胞穿破浆膜面侵入邻近毛细血管、间质向外浸润漫延生长,形成肠壁边缘的毛糙、棘状突起或肠壁邻近的脂肪组织内可见条索状或结节状软组织影的CT征象。有此种征象说明肿瘤已侵出浆膜或有肠外浸润。故认为对p53、Ki67抗原的检测有助于对结直肠癌的浆膜侵袭、肠外浸润的CT征象进行推断。图1直肠癌CPR重建局部肠壁增厚浸润,肿瘤未侵出浆膜图2降结肠癌局部肠腔狭窄肠壁边缘毛糙，肿瘤侵出浆膜图3同图2病例，CPR重建局部肠腔节段性狭窄、僵直图4直肠癌局部肠壁增厚,肠壁外缘棘状突起侵出浆膜，肠外浸润图5升结肠癌局部肠腔狭窄，肠壁边缘毛糙、棘状突起，肿瘤侵出浆膜图6同图4病例，肿瘤侵出浆膜，肠外浸润,区域性淋巴结转移3.5区域性淋巴结及远处转移与p53 、Ki67抗原表达关系对于区域性淋巴结转移的判断是CT诊断的一个难点,目前多数淋巴结转移的诊断标准是依靠其大小、强化程度,存在一定的局限性, 且不少研究发现较小淋巴结(直径<10mm甚至直径<5mm)的转移存在相当高的比例, 加上部分淋巴结与肿瘤或肠壁融合无法准确判断淋巴结转移,目前认为p53高表达的肿瘤具有强的侵袭力、转移力，并与淋巴结转移密切相关，提示预后不良[7]。有研究表明Ki67的高表达与结肠癌的肿瘤细胞分化程度、淋巴管浸润和肿瘤浸润深度呈显著性相关[10]。本组研究结果发现有区域性淋巴结或远处转移组的p53表达65.8%、Ki67抗原表达76.2%均高于无淋巴结及远处转移组的53.6%、64.7%,二者表达强度比较呈显著性相关。本组CT征象侵出浆膜肠外浸润组的转移率较肠壁浸润组高，由此可见p53、Ki67抗原表达强度较高的癌细胞增殖活性较高，更易发生肿瘤细胞侵入邻近毛细血管及伴行的淋巴管，促进区域性淋巴结及远处转移。本研究发现p53、Ki67抗原的表达强度较高与结直肠癌患者MSCT不能发现的微小转移淋巴结存在明显的相关性,提示可能存在微小的转移淋巴结,笔者认为p53、Ki67抗原的测定有助于对淋巴结转移的判定, 特别是对微小淋巴结转移可作为CT检查的补充。

　　4小结

　　结直肠癌侵袭性的MSCT征象可以一定程度反映p53 、Ki67两种基因的表达强度。可作为临床判断结、直肠癌的恶性程度的一个分子影像学的重要指标。结直肠癌侵袭性的MSCT征象与p53、Ki67两种基因检测相结合,可进一步提高对肠壁浸润的程度、区域性淋巴结转移和术前分期判定的正确性, 对结、直肠癌的术前及预后评价有重要价值。

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