点击显示 收起
【摘要】 目的 采用钙离子图像分析技术,研究补阳还五汤预干预对全脑缺血大鼠皮层神经元内Ca2+浓度的影响，探讨Ca2+信号异常参与缺血性神经元损伤的机制及补阳还五汤抗脑缺血的分子机制，为中药复方的研究探索新的思路和方法。方法 参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型,缺血后的大鼠分别在存活2、12、24、48及72h后进行皮层神经细胞急性分离、负载荧光指示剂Fura-2/AM，用钙离子成像系统检测单个神经细胞内Ca2+的浓度。结果 补阳还五汤预干预除再灌12h时点之外，可显著降低其他各时点大脑皮层神经元内Ca2+浓度，对缺血再灌后的2次Ca2+堆积均表现明显的抑制作用。结论 降低缺血再灌注不同时点皮层神经元内Ca2+浓度是补阳还五汤抗脑缺血的重要机制之一。
【关键词】 补阳还五汤；全脑缺血模型大鼠；再灌不同时点；大脑皮层神经元；钙离子浓度
Effects of Buyang huanwu tang on Ca2+ message of global cerebral cortical neurons of rats with ischemia and reperfusion at different time points
GUAN Li,DING Sheng-yuan,LUO Ming,et al.Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China
【Abstract】 Objective Application the ion-image analytical technique to simultaneously study the effects of Buyang huanwu tang on the intracellular Ca2+ concentrations of the ischemic rats’ cerebral cortical neurons, intensively discuss the mechanism that the abnormality of the neuronal Ca2+ message joins in the ischemic neuronal injury and the molecular mechanism of cerebral anti-ischemia with Buyang huanwu tang, and explore new ideas and methods for the research on the complex prescription.Methods Consulted the modified Pulsinelli’s tetra-vessel occlusion to prepare the global cerebral ischemic rats.The rat’s cerebral cortical cell was acquired in the acute separation method. And the Ca2+ concentration of a single neuron was tested by the Ca2+ image-forming system.Results The preintervention by Buyang huanwu tang could drop the Ca2+ concentration of the global cerebral cortical neurons of rats with ischemia and reperfusion at all time points except 12h, and obviously inhibit the two Ca2+ accumulations after ischemia and reperfusion. It was one of the main mechanisms of the cerebral anti-ischemia with Buyang huanwu tang to drop the Ca2+ concentration of the global cerebral cortical neurons of the rats with ischemia and reperfusion at different time points.Conclusion The preintervention by Buyang huanwu tang was of significant to the prevention and treatment of the ischemic neuronal injury.
【Key words】 Buyang huanwu tang; rats with ischemia and reperfusion; global cerebral cortical neurons; different time points; Ca2+ concentrations
脑缺血在祖国医学中属于“中风”范畴，气虚血瘀是致病的重要因素，故治则应为益气活血［1］。补阳还五汤具有补气活血化瘀之功，临床用于治疗缺血性脑血管疾病及其后遗症取得了卓越的疗效，对其保护缺血性损伤机制的研究也越来越受到人们的关注［2］。在有关其作用机制的实验研究方面，补阳还五汤对缺血脑组织中Ca2+代谢的影响日益受到关注，有学者对补阳还五汤对Ca2+的可能影响作了有益的探讨［3］，但尚未见从单细胞角度研究该方对Ca2+影响的报道。本研究从单细胞和离子通道角度对本方影响缺血性损伤神经元内Ca2+代谢的机制进行深入研究，为揭示该方保护缺血性损伤的机制、指导该方的临床应用提供实验依据。
中药复方是祖国医药学的重要组成部分，是中医临床用药的主要形式和手段。目前从整体水平对中药复方进行研究较多见，而从细胞、分子水平对中药的研究多见于对中药单体的研究。但中药应用以复方为主，多味中药往往协同作用，且中药复方在体内代谢复杂，纯粹单体的研究并不能很好地说明复方的作用机制。因此，本研究也从细胞、分子水平对中药复方的作用机制进行深入研究，为中药复方的研究探索新的思路和方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康成年SD大鼠，雌雄不限，体重200～250g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（粤）2003-0001，动物实验环境设施合格证号：粤检证字2003C017。
1.2 实验器材与药品
1.2.1 试剂和药物 细菌蛋白酶、TEA、HEPES、HBSS、EBSS，上述产品均购自Sigma公司；Fura-2购自Biotium公司。
1.2.2 实验器材 M752－振动切片机（美国）、ZEISS正置显微镜（美国）、小型三用水箱（国产）、BS210S电子天平（国产）、PHS-3C酸度计（国产）。
1.3 实验方法
1.3.1 实验分组 实验随机分为11组：（1）假手术组；（2）缺血再灌模型2h、12h、24h、48h、72h等5个时间点共5组；（3）补阳还五汤组预干预的缺血再灌模型2h、12h、24h、48h、72h等5个时间点共5组。实验前假手术组、模型组均用生理盐水灌胃5天，灌胃容积1ml/kg体重，1天2次。补阳还五汤组则给予浓度为0.64g/ml的补阳还五汤，灌胃容积1ml/kg体重，1天2次。
1.3.2 制作全脑缺血大鼠模型 参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法［3］制备：大鼠用水合氯醛（350mg/kg体重）腹腔注射麻醉。颈部正中切口，分离两侧颈总动脉约1cm将大鼠固定于定位仪上，枕部切口，暴露第一颈椎板及横突板上的翼小孔，用双极电凝针电凝双侧翼小孔内的椎动脉，缝合切口后待动物完全苏醒，将其移至笼内饲养，夜间禁食，此时动物行为正常，没有明显的脑损伤。24h后在大鼠完全清醒的状态下，用动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉15min，造成短暂的全脑缺血。大鼠在缺血开始后30～60s内昏迷，翻正反射消失，能自主呼吸，双侧瞳孔放大，痛觉反射消失，这些症状持续于整个缺血过程中，凡未出现以上症状或这些症状未能持续整个缺血过程中的大鼠弃用。缺血15min后解除动脉夹，恢复脑血流，动物即逐渐恢复知觉开始活动，未见明显障碍，凡缺血后有癫痫、偏瘫、惊厥等症状的大鼠均弃用。缺血后的大鼠分别在存活2、12、24、48及72h后进行皮层神经细胞急性分离和Ca2+图像测定。
1.3.3 脑片的制备与神经元的急性分离 成年SD大鼠（200～250g），迅速断头取脑，置于氧饱和的冰水互溶的高蔗糖液（0℃～4℃）中冷冻2min左右，然后用振动切片机在顶叶沿冠状面将其切成400μm厚的脑片。然后将切好的脑片置于通95%O2+5%CO2混合气的NaHCO3缓冲的EBSS液中孵育1～6h（室温），然后将脑片移入低Ca2+羟乙基磺酸钠缓冲液冲洗3次并分离出大脑皮层，放入33℃用100%O2饱和的HBSS液中用细菌蛋白酶XIV（1.1～1.4mg/ml）消化30～45min，然后用低Ca2+羟乙基磺酸钠缓冲液清洗3次，然后用尖端经火抛光处理的口径依次为500、300和150μm的吸管进行吹打，制成细胞悬液，并将其移入35mm培养皿，待细胞贴壁后，负载荧光指示剂Fura-2/AM。
1.3.4 负载荧光指示剂Fura-2/AM 急性分离的大鼠大脑皮层细胞静置30min使其贴于盖玻片上。待细胞贴壁后，加入Fura-2/AM，使其终浓度为5μmol/L，室温25℃～26℃负载45min，中间晃动2次。再用负载液无钙HBSS冲洗3次以除去胞外残余的Fura-2/AM，将盖玻片移至培养皿中，皿中为含有1.3mmol/L CaCl2的HBSS液浴液。
1.3.5 钙离子成像系统检测单个神经细胞内Ca2+的浓度 将装有盖玻片的培养皿移至荧光显微镜的载物台上，用胶布固定。在Tillvison中设置荧光激发方案，交替用波长340nm与380nm波长激发，曝光时间为40ms，每个循环之间的时间间隔为最短。用Tillvison软件进行图像分析，记录340nm与380nm处荧光强度，除去自发荧光后计算出F340/F380比值，用此比值代表Ca2+浓度。
1.4 统计学方法 所有数据均用平均值±标准差表示。用单变量方差分析，显著性水平为0.05。
2 结果
2.1 全脑缺血再灌后不同时点皮层神经元内Ca2+浓度的改变 缺血再灌后2h，大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度升高，与假手术组相比差异有显著性。再灌12h，大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度降低，与假手术组相比，差异无显著性。再灌24h，大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度再次升高，与假手术组相比差异有显著性。再灌48h，大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度仍保持在较高水平，与假手术组相比差异仍有显著性。再灌72h，大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度下降，但与假手术组相比，差异仍有显著性。见表1和图1。
2.2 补阳还五汤对全脑缺血大鼠再灌后不同时点皮层神经元内Ca2+浓度的影响 经补阳还五汤预干预的假手术大鼠，大脑皮层神经元内Ca2+浓度与未干预假手术组大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度相比，有显著性降低。经补阳还五汤预干预的全脑缺血大鼠，再灌注2h，大脑皮层神经元内Ca2+浓度与假手术组相比，有显著性增高，与同时点模型组相比，却有显著性降低。再灌12h，大脑皮层神经元内Ca2+浓度与假手术组相比，有显著性升高；与同时点模型组相比，差异无显著性。再灌24h，大脑皮层神经元内Ca2+浓度与假手术组相比，有显著性升高；与同时点模型组相比，却有显著性降低。再灌48h，大脑皮层神经元内Ca2+浓度与假手术组相比，有显著性升高；与同时点模型组相比，却有显著性降低。再灌72h，大脑皮层神经元内Ca2+浓度与假手术组比，有显著性升高；与同时点模型组相比，却有显著性降低。显示补阳还五汤预干预对降低全脑缺血再灌注模型大鼠大脑皮层神经元神经元内Ca2+浓度有一定作用，尤其在缺血再灌大脑皮层神经元神经元内Ca2+浓度出现高峰的两个阶段：再灌注2h和24h、48h、72h作用更为显著。见表1和图1、图2。表1 补阳还五汤对全脑缺血再灌后不同时点皮层神经元内Ca2+浓度的影响注：与假手术组相比，*P＜0.05；与缺血再灌模型同时点组相比，△P＜0.01
3 讨论
脑缺血和再灌注会强烈干扰神经元的Ca2+稳态，而Ca2+信号异常在缺血性神经元损伤中起重要作用［4］。一般认为脑缺血后Ca2+自稳态破坏，细胞内Ca2+积聚，Ca2+超载，触发了一个复杂的有害反应链,导致神经细胞功能和结构的损害，大量神经元退变坏死［5］。进一步的研究揭示，钙超载会导致神经细胞发生迟发性神经元坏死［6］。近年来，又发现脑缺血再灌注可以诱导神经元凋亡，神经元凋亡参与了脑缺血损伤，钙超载参与了神经元的凋亡［7］。随着人们对缺血再灌注损伤机制研究的进一步深入，人们发现脑缺血再灌注后，胞内Ca2+升高呈阶段性改变，提示再灌注时Ca2+在细胞内的再次堆积是细胞迟发性死亡的原因［8］。
补阳还五汤系清·王清任《医林改错》首载，该方由黄芪、当归、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成，有补气、活血、通络的功效，是历来中医临床治疗中风病常用方，对中风后遗症疗效显著［4］。近年来的研究表明，补阳还五汤治疗缺血性脑血管病的作用机制与扩张脑血管、增加脑血流量、改善脑循环、改善血液流变性、抗血小板活化、抗血栓形成以及改善脑代谢有关［2］。也有学者对补阳还五汤对Ca2+的可能影响做了有益的探讨，孙忠等［3］在中风后遗症“气虚血瘀”大鼠模型的基础上，用原子分光光度计法观察补阳还五汤对其脑组织中Ca2+的影响，发现补阳还五汤对中风后遗症“气虚血瘀”大鼠模型脑组织中Ca2+的升高有对抗和治疗作用。但目前对补阳还五汤抗脑缺血Ca2+超载机理的研究尚未深入到细胞和离子通道水平。在本研究中，补阳还五汤预干预除再灌12h时点之外，可显著降低其他各时点大脑皮层神经元内Ca2+浓度。因为Ca2+信号异常是缺血性神经元损伤的最后通路，因此结合本实验的结果和前人的研究成果，我们认为降低缺血再灌注不同时点大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度是补阳还五汤抗脑缺血的重要机制之一。
【参考文献】
1 陶根鱼,杜晓泉.益气活血法在缺血性中风病中的地位.陕西中医学院学报，1998,21:1.
2 郭平,王晶,王浩. 补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤作用机制的研究. 中药药理与临床，2001,17(2):3-4.
3 孙忠,彭康.补阳还五汤对中风后遗症“气虚血瘀”大鼠脑组织Na+、K+、Ca2+和Mg2+的影响.中国临床康复, 2004, 8(7):1296-1298.
4 Dimagl U, Iadecola C, Moskonitz MA. Pathobiology of ischaemic stroke: an intergrated view. Trends Nuerosci, 1999, 22(9): 391-397.
5 Matsumoto M, Scheller M S,Zornow M H, et al. Effects of semopamil,nimodipine,and mildhypothermia on-hippocampal glutamate concentrations after repeated cerebral ischemia in rabbits. Stroke，1990，21:1727-1733.
6 Kato H, Araki T, Hara H,et al. Sequential changes in muscarinicacetyl choline,adenosine A1 and calcium anta-gonist binding sites in the gerbil hippocampus following repeated brief ischemia. Brain Res，1991，553:33-38.
7 kamoto M, Matsumoto M, Ohtsuki T, et al. Inter nucleosomal DNA cleavage in volved in ischemia-induced neuronal death. Biochem Biophys Res Commun, 1993，196(3): 1356.
8 Connor JA, Razami-boroujerdi S, Greenwood AC, et al. Reduced voltage-dependent Ca2+ signaling in CA1 neurons after brief ischemia in gerbils. J Neurophysiol, 1999, 81(1):299-306.
作者单位： 1 510405 广东广州，广州中医药大学
2 510220 广东广州，广州红十字会医院
(编辑：悦 铭)